L-精氨酸从胞内分泌到胞外依靠的是转运蛋白LysE。本发明专利技术以首次以钝齿棒杆菌为研究菌株，构建了携带自身lysE基因的穿梭表达质粒pJC-tac-lysE并电转入钝齿棒杆菌中，获得加强lysE基因表达的重组钝齿棒杆菌。并对原始菌及重组菌进行平板显色定性检测和基本培养基培养实验考查L-精氨酸转运情况，验证了L-精氨酸转运蛋白LysE在钝齿棒杆菌中的过量表达，说明增强LysE的表达能够一定程度上降低胞内L-精氨酸的浓度提高L-精氨酸的产量。并对原始菌和重组进行250mL摇瓶发酵实验，结果表明，重组菌L-精氨酸产量提高了约12％，产率最大时提高了11.1％，且发酵周期有所缩短。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及通过加强IysE基因在钝齿棒杆菌的表达提高L-精氨酸产量，属于基因工程
技术介绍
L-精氨酸是人体和动物体内的半必需 碱性氨基酸，是合成蛋白质肌酸的重要原料，也是生物体尿素循环的ー种重要中间代谢产物，具有多种独特的生理和药理作用。L-精氨酸在临床医药、食品、化妆品以及有关生物研究領域中用途广泛。发酵法是目前L-精氨酸商业化生产比较有效和经济的方法。増加合成途径中酶的表达量是提高L-精氨酸合成途径的代谢通量最终提高其产量最重要的策略之一，这也是代谢工程育种的主要手段，但研究发现，微生物细胞内氨基酸合成的通量増加会导致细胞内产物的积累量远高于野生型菌株，这表明改造后的菌株虽然一定程度上増加了目的产物的产量但产物的转运能力却是有限的。降低胞内产物L-精氨酸浓度解除其合成代谢途径中关键酶的反馈抑制和反馈阻遏有利于进ー步提高L-精氨酸合成途径的代谢通量实现L-精氨酸的过量生产。在细菌中，氨基酸转运系统成分非常复杂，它由许多具有特定结构和功能的转运蛋白家族成员组成。在诸多氨基酸转运蛋白中，来源于谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸转运蛋白LysE的研究最多，1996年，Vrl jic等人成功克隆了 L-赖氨酸转运蛋白基因lysE，该基因的产物LysE由236个氨基酸构成，分子量约为25kD，其结构和功能都很新颖。2001年，德国学者L. Eggeling等人通过弓I物延伸及融合表达等实验证明位于L-赖氨酸转运蛋白基因IysE上游的IysG基因是其转录的正调控基因，并找出了 IysE基因转录的起始位点。他们还发现，尽管L-赖氨酸转运蛋白对L-精氨酸表现出较弱的亲和カ(Km ^ 20mM)，但L-赖氨酸转运蛋白LysE几乎以相同的速率从细胞内向细胞外转运L-赖氨酸和L-精氨酸。综上所述，转运蛋白LysE在降低胞内L-精氨酸浓度解除其合成代谢途径中关键酶的反馈抑制和反馈阻遏，进ー步提高其产量发挥重要作用，研究IysE基因编码的转运蛋白LysE对实现精氨酸的过量生产有着非常重要的生产指导意义。针对L-精氨酸发酵中代谢通量的増加引起胞内产物浓度的过度积累，抑制L-精氨酸产量进ー步提高的问题，本专利技术首次以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5为研究菌株，通过加强IysE基因在钝齿棒杆菌的表达降低L-精氨酸的胞内浓度，以解决包内产物积累引起的反馈阻遏及反馈抑制问题。C. crenatum SYPW是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株(菌株的保藏编号为CCTCC NO M208133)，SYPA 5-5是此菌株经过传代5次后得到的菌株，其菌株特性在传代中与SYPW保持一致。目前，尚未见关于钝齿棒杆菌精氨酸转运蛋白LysE的具体研究报道。
技术实现思路
本专利技术首先从钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) SYPA5-5 (菌株的保藏编号为CCTCC NO M208133)中克隆出编码转运蛋白的基因lysE，并将该基因与穿梭表达质粒pJC-tac连接(pJC-tac详细构建过程及其特征已在已申请的专利中公开,专利公开号CN101397548A)，成功构建了携带IysE基因的穿梭表达质粒pJC-tac-lysE，并电转入钝齿棒杆菌SYPA5-5中，获得加强IysE基因表达的重组钝齿棒杆菌pJC-tac-lysE/C. crenatum。并对原始菌及重组菌进行平板显色定性检测和基本培养基培养实验考查L-精氨酸转运情况，验证了 L-精氨酸转运蛋白LysE在钝齿棒杆菌中的过量表达，说明增强LysE的表达能够一定程度上降低胞内L-精氨酸的浓度提高L-精氨酸的产量。基于以上研究，对原始菌以及重组菌进行250mL摇瓶发酵实验，结果表明，与原始菌株相比，重组菌精氨酸产量提高了约12%，产率最大时提高了 11. 1%，且发酵周期有所缩短。附图说明图I重组质粒pMD18-T_lysE酶切验证结果I. DNAMaker DL2000 ；2. PCR product of IysE gene ;3.pMD18-T_lysE/BamHI ;4.pMD18-T-lysE/BamHI+SalI；5.入DNA/Hindlll图2C. crenatum SYPA 5-5 与 C. glutamicum ATCC 13032 精氨酸转运蛋白基因IysE核苷酸对比图3重组穿梭表达质粒pJC-tac-lysE的酶切验证I. DNA Marker DL2000 ；2.IysE gene ;3.pJC-tac/Sall ;4.pJC-tac-lysE/Sall ;5.pJC-tac-lysE/Sall+BamHI；6.入DNA/Hindlll图4抗性平板上重组钝齿棒杆菌pJC-tac-lysE/C. crenatum 5-5阳性转化子的筛选图5平板显色法检测两种钝齿棒杆菌L-精氨酸分泌情况3. C. crenatum ；4. pJC-tac-lysE/C. crenatum图6钝齿棒杆菌基本培养基中胞内外L-精氨酸水平注图中测量值为三个平行的平均值A.细胞菌体量；B.胞内L-精氨酸含量；C.胞外L-精氨酸含量图7钝齿棒杆菌各菌株250mL摇瓶发酵过程曲线注图中测量值为三个平行的平均值A.菌体生长量g/L ；B.葡萄糖残留量％图8钝齿棒杆菌各菌株250mL摇瓶发酵过程曲线注图中测量值为三个平行的平均值A.胞内L-精氨酸含量g/g ；B.胞外L-精氨酸含量(产量)g/L ；C. L-精氨酸的产率g/L/h图9钝齿棒杆菌各菌株中氨基酸含量的分析A C. crenatum SYPA5-5B pJC-tac-lysE/C. crenatum具体实施方法实施例I :目的基因的扩增及重组钝齿棒杆菌的构建以C. crenatum SYPA5-5 染色体基因组为模板，以 CclysE F BamHI 和 CclysER Sal I为引物，PCR扩增获得含有BamHI和Sal I两个酶切位点的IysE基因，与PMD18-T Vector 连接，构建克隆载体 pMD18-T_CclysE (BamHI+Sal I)，将克隆载体pMD 18-T-CclysE (BamHI+Sa 11)转化至受体大肠杆菌中，涂布于含Amp的LB琼脂平板上，37°C培养过夜后，随机挑取阳性转化子酶切鉴定后送上海生工测序并进行序列分析，用BamHI和Sal I双酶切得到含有BamHI和Sal I两个酶切位点的IysE基因，与同样双酶切的穿梭表达载体pJC-tac连接,得到重组穿梭表达载体pJC-tac-lysE酶切验证,后以电击转化的方法转化钝齿棒杆菌C. crenatum5-5在Kan抗性LB平板上筛选阳性转化子，即得到重组纯齿棒杆菌 pJC-tac-lysE/C. crenatum5_5。以C. crenatu m SYPA5_51ysE基因(CclysE)为模板，设计两条引物，PCR扩增CclysE,引物设计如下CclysE F BamHI :5’ -CGCGGATCCATGGAAATCTTCATTACAGG-3 CclysE R Sal I :5’ -CGCGTCGACCTAACCCATCAACATCAG-3，PCR扩增获得基因产本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种加强了lysE基因表达的重组钝齿棒杆菌pJC？tac？lysE/C.crenatum，其特征在于：将精氨酸转运蛋白编码基因lysE构建成为重组穿梭表达质粒pJC？tac？lysE并克隆至保藏编号为CCTCC？NO：M208133的钝齿棒杆菌中从而提高了钝齿棒杆菌向胞外分泌精氨酸的能力，并且lysE基因是来源于保藏编号为CCTCC？NO：M208133的钝齿棒杆菌。
【技术特征摘要】
1.一种加强了 IysE基因表达的重组钝齿棒杆菌pJC-tac-lysE/C. crenatum,其特征在于将精氨酸转运蛋白编码基因IysE构建成为重组穿梭表达质粒pJC-tac-lysE并克隆至保藏编号为CCTCC NO M208133的钝齿棒杆菌中从而提高了钝齿棒杆菌向胞外分泌精氨酸的能...
【专利技术属性】
技术研发人员：许正宏，饶志明，徐美娟，张博慧，杨娟，刘巧利，窦文芳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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