【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体，属于基因工程和酶工程。
技术介绍
1、l-天冬氨酸α-脱羧酶(l-aspartateα-decarboxylase，ec 4.1.1.11，adc)能特异性识别l-天冬氨酸(l-asp)，并催化l-天冬氨酸脱羧生成β-丙氨酸，是制备β-丙氨酸的核心酶。β-丙氨酸又名3-氨基丙酸，虽然不直接参与蛋白质的合成，却是生物合成含氮化合物的重要中间体，可广泛应用于食品、饲料、化工及医药等领域，具有巨大的应用潜力与广阔的市场前景。
2、目前，β-丙氨酸的主要生产方法为化学法，虽然生产效率高、生产成本较低，但是该方法存在污染严重、产物有毒、能耗较大、纯化困难，条件苛刻、设备易损等难以解决的问题。因此，绿色环保且条件温和的酶法，成为了当前更有前景的β-丙氨酸制备方法。目前，用于制备β-丙氨酸的l-天冬氨酸α-脱羧酶主要来自枯草芽孢杆菌、杰氏棒杆菌、赤拟谷盗。然而，野生型l-天冬氨酸α-脱羧酶及其突变体普遍存在酶活较低及底物耐受性差的问题，在实际的催化转化过程中，需要较高的加酶量或全细胞浓度才可达到一定的β-丙氨酸产量，且转化时间较长，需要添加辅酶，增大了纯化难度，提高了生产成本。例如，张腾辉等对枯草芽孢杆菌来源的l-天冬氨酸α-脱羧酶进行e56s位点定向突变，利用od600＝80的全细胞进行9h转化，最终可获得215.3g·l-1的β-丙氨酸产物；陈虹通过对赤拟谷盗来源的l-天冬氨酸α-脱羧酶进行r38h及k351s双突变，利用od600＝80的全细胞进行48h转化，最终获得了170.5g
3、天冬氨酸拥有d-型与l-型两种手性构象，两种构象氨基酸各自的功能和应用差异显著，因此，dl-天冬氨酸(dl-asp)的手性拆分对医学、保健、食品等领域都具有重要意义。目前较为成熟的氨基酸手性拆分法为化学拆分法，但是该方法收率较低，副产物较多，且光学纯度不高。酶法拆分具有高度立体的专一性，且反应条件温和，但目前dl-天冬氨酸手性拆分用酶仅为l-天冬氨酸β-脱羧酶，产物为高附加值的d-天冬氨酸和附加值较低的l-丙氨酸。未见l-天冬氨酸α-脱羧酶进行酶法拆分联产两种高附加值产品d-天冬氨酸和β-丙氨酸的报道。此外，由于l-天冬氨酸或dl-天冬氨酸都是酸性底物，转化过程中底物的添加会导致反应体系ph降低到5.0以下，随着反应的进行ph回升到7.0附近，整个反应过程ph一直不断振荡，容易导致l-天冬氨酸α-脱羧酶的反应效率降低甚至酶失活。在反应过程中，l-天冬氨酸α-脱羧酶的活性口袋中的识别位点arg会首先对底物的γ-cooh离子键进行识别与结合，之后原ser位置上的丙酮酰基会与l-天冬氨酸的氨基相结合，生成一种亚胺类的中间体。在丙酮酰基活性中心周围其它疏水残基的影响下，α-位的羧基会发生分子内的重排，释放出co2。最后，亚胺类中间体发生水解反应，通过接受tyr残基提供的质子，重新形成具有催化活性的l-天冬氨酸α-脱羧酶及β-丙氨酸产物。但是，在重新形成丙酮酰基的过程中，存在两种不同的质子化过程，当底物被质子化时，会生成正确的产物并重新形成具有催化活性的丙酮酰基基团；当酶的丙酮基被质子化时，一个氨基就会转移到丙酮基上，从而造成l-天冬氨酸α-脱羧酶的失活。另外，已有的l-天冬氨酸α-脱羧酶普遍酶活较低，底物耐受性不佳，容易失活，导致催化转化性能较差，与实际的工业化生产应用还有较大差距。
4、因此，寻找一种耐受低ph、并且可以在更宽ph范围具有稳定性的，更高催化能力的新型l-天冬氨酸α-脱羧酶对dl-天冬氨酸酶法拆分的工业化应用具有重要意义。
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术的目的是提供了一种l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体。
2、技术方案：本专利技术所述的一种l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体，所述l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体是通过将出发氨基酸序列如seq id no.2所示的l-天冬氨酸α-脱羧酶中的第46位、88位、92位以及126位氨基酸进行突变得到的。
3、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体是通过在出发氨基酸序列如seq id no.1所示的l-天冬氨酸α-脱羧酶中的第46位异亮氨酸残基被替换成缬氨酸残基第88位异亮氨酸残基被替换成甲硫氨酸残基，第92位亮氨酸残基被替换成精氨酸残基，并将第126位异亮氨酸残基被替换成精氨酸残基得到的，命名为baadc-i46v-i88m-l92r-i126r。
4、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-天冬氨酸α-脱羧酶来源于阿氏芽孢杆菌(bacillus aryabhattai)gel-09。
5、本专利技术还提供了编码上述l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的基因。
6、在本专利技术的一种实施方式中，编码所述l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7、本专利技术还提供了携带上述基因的表达载体。
8、在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体的载体为pet载体、pgex载体、ppicz载体。
9、在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pet24a(+)载体。
10、本专利技术还提供了携带上述基因或上述表达载体的宿主细胞。
11、在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。
12、在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
13、在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌e.coli bl21(de3)或大肠杆菌jm109。
14、本专利技术还提供了上述l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的制备方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，收集发酵获得的发酵液进行离心，离心结束后，从离心获得的细胞沉淀物中分离上述l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体。
15、本专利技术还提供了应用上述方法制备得到的l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体。
16、本专利技术还提供了一种制备β-丙氨酸的方法，以所述突变体，或所述宿主细胞为催化剂，以l-天冬氨酸或dl-天冬氨酸为底物进行反应。
17、在本专利技术的一种实施方式中，在37℃、200rpm，至少反应12h。
18、本专利技术还提供了一种拆分dl-天冬氨酸的方法，以所述突变体，或所述宿主细胞为催化剂，以dl-天冬氨酸为底物进行反应，在37℃、200rpm，至少反应12h。
19、本专利技术还提供了所述突变体，或所述基因，或所述表达载体，或所述宿主细胞在制备β-丙氨酸或拆分dl-天冬氨酸方面的应用。
20、有益效果：
21、1、本专利技术l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的比酶活有了明显的提高，利用本专利技术的方法将携带编码本专利技术l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体baadc-i46v-i88m-l92r本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶的第46位异亮氨酸突变为缬氨酸，第88位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，第92位亮氨酸残基被替换成精氨酸，并且第126位异亮氨酸残基被替换成精氨酸。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的表达载体，其特征在于，所述载体包括pET载体、pGEX载体和pPICZ载体。
4.携带权利要求2所述基因，或权利要求3所述表达载体的重组微生物细胞。
5.如权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述重组微生物细胞为细菌或真菌。
6.一种制备β-丙氨酸的方法，其特征在于，以权利要求1所述突变体，或权利要求4或5所述重组微生物细胞为催化剂，以L-天冬氨酸为底物进行反应。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述反应的体系包括权利要求4或5所述重组微生物细胞、L-天冬氨酸和磷酸缓冲液；所述体系中，所述重组微生物细胞的终浓度为20～80g/L。
8.一种拆分DL-天冬氨酸的方法，其
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述反应的体系包括权利要求4或5所述重组微生物细胞、DL-天冬氨酸和磷酸缓冲液；所述体系中，所述重组微生物细胞的终浓度为20～80g/L。
10.权利要求1所述突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述表达载体，或权利要求4或5所述重组微生物细胞在制备β-丙氨酸或拆分DL-天冬氨酸方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种l-天冬氨酸α-脱羧酶突变体，其特征在于，将氨基酸序列如seq id no.2所示的l-天冬氨酸α-脱羧酶的第46位异亮氨酸突变为缬氨酸，第88位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，第92位亮氨酸残基被替换成精氨酸，并且第126位异亮氨酸残基被替换成精氨酸。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的表达载体，其特征在于，所述载体包括pet载体、pgex载体和ppicz载体。
4.携带权利要求2所述基因，或权利要求3所述表达载体的重组微生物细胞。
5.如权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述重组微生物细胞为细菌或真菌。
6.一种制备β-丙氨酸的方法，其特征在于，以权利要求1所述突变体，或权利要求4或5所述重组微生物细胞为催化剂，以l-天冬氨酸为底物进行反应...
【专利技术属性】
技术研发人员：段绪果，丁乾，魏梓佳，樊宇成，赵杨，张槿博，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。