【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和生物，特别涉及一种人工改造的植物胚乳特异性启动子enhgt13a及其应用。
技术介绍
1、通过植物基因工程在植物细胞表达和生产各种重组蛋白，又称为分子医药技术(molecular pharming)，其重组蛋白制品称为植物源重组药物(plant-madepharmaceutical，pmp)。目前，在基因工程植物中成功表达的重组药物有激素类、抗体类、酶类、细胞因子类、血浆蛋白因子和疫苗等。分子医药技术在重组蛋白生产中表现出来的诸多优点，尤其是水稻胚乳作为理想重组蛋白表达器官具有如下优势：1)水稻作为模式植物，遗传背景清晰，基因组信息详实；2)遗传转化技术成熟；3)水稻为自花授粉，其异花授粉的频率非常低，通常小于1-5％，基因飘流频率仅为0.036％，而且花粉离体后5min失去活性，具有较好的生物安全性；4)水稻种子成熟脱水后为重组蛋白提供了良好的储藏环境，重组蛋白不易降解便于长期储藏与运输；5)水稻胚乳储藏蛋白种类少，且溶解性较低，易于目的蛋白的分离纯化；6)近期的研究表明，在水稻胚乳中生产的重组糖蛋白呈现低免疫原性；7)水稻种植及田间管理较容易，便于基因工程水稻规模化种植。
2、重组蛋白的表达量高低直接影响到产品成本和市场竞争力，是影响pmp产品是否能进入市场的关键。因此，持续提高重组蛋白表达量是分子医药技术研究的永恒主题，近二十年来，为了提高重组蛋白在植物细胞中表达量，开展了大量研究并取得了较大进展。提高重组蛋白表达量的策略主要体现在以下几个方面：1)选择转录活性高的启动子来增加外源基因的
3、专利zl200510019084.4和zl200610019285.9中描述了水稻储藏蛋白gt13a启动子的应用，虽然gt13a启动子是编码水稻13个水稻储藏谷蛋白基因中转录活性最强的启动子(kusaba et al.,(2003)low glutelin content1:a dominant mutation thatsuppresses the glutelin multigene family via rna silencing in rice.plant cell15:1455-1467)，介导重组人血清白蛋白在水稻胚乳细胞中的产量达到2.75克/公斤糙米(he et al.,(2011)large-scale production of functional human serum albuminfrom transgenic rice seeds,proc.natl.acad.sci.usa 2011.vol.108(47):19078-19083)，要进一步提高重组蛋白表达量必须需要更高转录活性的启动子。由于gt13a启动子是水稻储藏蛋白基因中最强的启动子，无法从自然界获得比现有gt13a转录活性更高的启动子。因此，要获得比自然界比gt13a更高转录活性启动子就是通过基因工程方法人工创制更高转录活性的启动子，来进一步提高重组蛋白在水稻胚乳细胞的表达量。
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的是提供一种人工改造的植物胚乳特异性启动子enhgt13a(enhanced gt13a)及其应用，进一步提高重组蛋白在水稻胚乳细胞的表达，通过对水稻谷蛋白亚基基因gt13a(os01g0762500，eu264102)的启动子的顺式作用元件进行人工定点突变，移除部分负向调控转录顺式作用元件(阻遏子)和产生新正向调控顺式作用元件(增强子或tata盒的增强子以及核基质附着区，matrix attachment region,mar等)，从而提高启动子的转录活性，进而提高外源蛋白的表达量。
2、本专利技术提供以下技术方案：
3、一种改造的植物胚乳特异性表达启动子，具有如序列表seq id no.1至seq idno.5任一项所示的核苷酸序列。具体地，具有如下核苷酸序列：
4、1)具有seq id no.1所示的dna序列；该序列是由gt13a启动子(如seq id no.6所示)在其5’端缺失了281碱基而产生的gt13a△281bp截短的启动子；或
5、2)具有seq id no.2所示的dna序列；该序列是seq id no.1所示的dna序列在322，708和712处定点g→t突变；在733处定点g→a突变而产生的富含at的人工改造启动子；或
6、3)具有seq id no.3所示的dna序列；该序列是seq id no.1所示的dna序列在620处的cc突变成tt，产生了新的caat；在340处插入tacaaatgatgtgtcaatta ca序列，产生了3个caat元件而形成的gt13a△281+caat新候选启动子；或
7、4)具有seq id no.4所示的dna序列；该序列是seq id no.1所示的dna序列在301-322处缺失了aagtcataactgat motif；在555处缺失了一个cagtg元件；在708处将gaaag突变为caatt而形成的del新候选启动子；或
8、5)具有seq id no.5所示的dna序列；该序列是seq id no.1所示的dna序列在808处插入了atatcatgagtcacttcat序列；在841处插入了aacaaactctatctt aacatt序列，增加了2个gcn4元件，形成的富含gcn4元件的新候选启动子。
9、优选地，本专利技术改造的植物胚乳特异性表达启动子，具有如序列表seq id no.1或seq id no.2所示的核苷酸序列。
10、根据本专利技术，所述植物胚乳特异性表达启动子的下游连接医用或工业用蛋白或多肽基因、结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因，用于驱动结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因的表达，调控代谢产物的基因，调节调控代谢产物的基因的反义基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备重组猫血清白蛋白的方法，包括步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其中步骤1)所述的表达载体是将所述EnhGt13a启动子和表达猫血清白蛋白的基因转入植物表达质粒形成的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述植物表达质粒为农杆菌表达质粒，步骤2)所述宿主菌为农杆菌。
4.一种植物表达载体，包含经改造的植物胚乳特性表达启动子EnhGt13a和表达猫血清白蛋白的基因；其中所述的植物胚乳特异性表达启动子EnhGt13a的序列如SEQ ID NO.2所示，所述表达猫血清白蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体包括植物表达质粒和转入其中的所述EnhGt13a启动子和表达猫血清白蛋白的基因。
6.一种宿主菌，包含权利要求4所述的植物表达载体。
7.根据权利要求6所述的宿主菌，其特征在于所述宿主菌是农杆菌。
8.一种重组猫血清白蛋白，通过权利要求1所述的方法制备。
【技术特征摘要】
1.一种制备重组猫血清白蛋白的方法，包括步骤：
2.根据权利要求1所述方法，其中步骤1)所述的表达载体是将所述enhgt13a启动子和表达猫血清白蛋白的基因转入植物表达质粒形成的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述植物表达质粒为农杆菌表达质粒，步骤2)所述宿主菌为农杆菌。
4.一种植物表达载体，包含经改造的植物胚乳特性表达启动子enhgt13a和表达猫血清白蛋白的基因；其中所述的植物胚乳特异性表达启动子enhgt13...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨代常，李坤鹏，
申请(专利权)人：武汉禾元生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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