一种改造的植物胚乳特异性启动子及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种改造的水稻胚乳特异性启动子，具有如SEQ ID NO.1至5任一项所示的序列，其中SEQ ID NO.2所示的EnhGt13a启动子在体外驱动GUS活性、介导外源蛋白在水稻胚乳细胞表达都比未改造的Gt13a启动子显著提高，在改良种子品质、分子医药的研究等领域有极大的应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
from transgenic rice seeds,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2011.vol.108(47):19078-19083)，要进一步提高重组蛋白表达量必须需要更高转录活性的启动子。由于Gt13a启动子是水稻储藏蛋白基因中最强的启动子，无法从自然界获得比现有Gt13a转录活性更高的启动子。因此，要获得比自然界比Gt13a更高转录活性启动子就是通过基因工程方法人工创制更高转录活性的启动子，来进一步提高重组蛋白在水稻胚乳细胞的表达量。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的是提供一种人工改造的植物胚乳特异性启动子EnhGt13a(Enhanced Gt13a)及其应用，进一步提高重组蛋白在水稻胚乳细胞的表达，通过对水稻谷蛋白亚基基因Gt13a(Os01g0762500，EU264102)的启动子的顺式作用元件进行人工定点突变，移除部分负向调控转录顺式作用元件(阻遏子)和产生新正向调控顺式作用元件(增强子或TATA盒的增强子以及核基质附着区，Matrix Attachment Region,MAR等)，从而提高启动子的转录活性，进而提高外源蛋白的表达量。
[0006]本专利技术提供以下技术方案：
[0007]一种改造的植物胚乳特异性表达启动子，具有如序列表SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5任一项所示的核苷酸序列。具体地，具有如下核苷酸序列：
[0008]1)具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列；该序列是由Gt13a启动子(如SEQ ID NO.6所示)在其5
>’
端缺失了281碱基而产生的Gt13a
△
281bp截短的启动子；或
[0009]2)具有SEQ ID NO.2所示的DNA序列；该序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列在322，708和712处定点G
→
T突变；在733处定点G
→
A突变而产生的富含AT的人工改造启动子；或
[0010]3)具有SEQ ID NO.3所示的DNA序列；该序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列在620处的CC突变成TT，产生了新的CAAT；在340处插入TACAAATGATGTGTCAATTA CA序列，产生了3个CAAT元件而形成的Gt13a
△
281+CAAT新候选启动子；或
[0011]4)具有SEQ ID NO.4所示的DNA序列；该序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列在301-322处缺失了AAGTCATAACTGAT motif；在555处缺失了一个CAGTG元件；在708处将GAAAG突变为CAATT而形成的DEL新候选启动子；或
[0012]5)具有SEQ ID NO.5所示的DNA序列；该序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列在808处插入了ATATCATGAGTCACTTCAT序列；在841处插入了AACAAACTCTATCTT AACATT序列，增加了2个GCN4元件，形成的富含GCN4元件的新候选启动子。
[0013]优选地，本专利技术改造的植物胚乳特异性表达启动子，具有如序列表SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0014]根据本专利技术，所述植物胚乳特异性表达启动子的下游连接医用或工业用蛋白或多肽基因、结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因，用于驱动结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因的表达，调控代谢产物的基因，调节调控代谢产物的基因的反义基因。
[0015]本专利技术还提供含有上述任一项植物胚乳特异性表达启动子的表达盒。
[0016]本专利技术还提供含有上述任一项植物胚乳特异性表达启动子的重组表达载体。
[0017]所述重组表达载体是上述表达盒与质粒、运载载体表达所构建的重组蛋白表达载体，所述重组蛋白表达载体为重组蛋白植物表达载体，所述重组蛋白植物表达载体含有上
述表达盒并且能够将所述的表达盒转入植物宿主细胞、组织或器官及其后代并且能够整合到宿主的基因组中。
[0018]所述重组蛋白表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织或器官，得到基因工程或转基因植物细胞或组织或器官以及由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。
[0019]本专利技术还提供含有上述任一项植物胚乳特异性表达启动子的宿主菌。
[0020]本专利技术还提供含有上述任一项植物胚乳特异性表达启动子的基因工程植物、细胞系或转基因植物或细胞系。
[0021]本专利技术还提供上述植物胚乳特异性表达启动子在制备基因工程植物或转基因植物中的应用。
[0022]本专利技术还提供上述植物胚乳特异性表达启动子在表达任何一种重组蛋白或代谢产物的基因工程植物或转基因植物中的应用。
[0023]利用该植物胚乳特异性启动子培育胚乳特异性表达外源基因的植物方法也属于本专利技术的保护范畴。
[0024]所述培育胚乳特异性表达外源基因的植物方法，通过植物表达载体转入植物中，筛选得到在胚乳中特异性表达所述外源基因的转基因植物。
[0025]其中所述转基因植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可以是水稻、小麦、玉米、大麦、粟子、高粱或燕麦等禾本科植物；所述双子叶植物可以是大豆、油菜或向日葵。
[0026]本专利技术还提供一种猫血清白蛋白(FSA)重组蛋白，具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
[0027]本专利技术还提供一种重组表达载体，含有编码上述猫血清白蛋白重组蛋白的核苷酸序列。
[0028]本专利技术还提供一种用于扩增FSA基因的特异性引物，其中正向引物具有如SEQ ID No.9所示的序列(AGCTACCAGGGCAACAGCGA)；反向引物具有如SEQ ID No.10所示的序列(ATCTCGTAGAGGTACTTGCCGA)。
[0029]与现有启动子Gt13a相比，本专利技术的改造启动子的有益效果体现在：
[0030]1)通过对Gt13a缺失后得到新的启动子序列，较改造前的β-葡糖苷酸酶(GUS)基因转录活性提高了7.2％的转录活性；
[0031]2)在Gt13a缺失后得到的新启动子序列基础上，对调控转录活性的核心区域定点突变获得EnhGt13a启动子，经体外水稻未成熟胚乳瞬时GUS表达体系检测，比未改造的Gt13a介导的相对GUS活性提高了28.52％；
[0032]3)本专利技术的EnhGt13a启动子驱动外源基因稳定表达，显著提高胚乳生物反应器的外源重组蛋白表达水平，介导FSA表达量较未改造的Gt13a介导的FSA表达量增加了46.57％；
[0033]4)本专利技术的EnhGt13a启动子介导GUS报告基因能在水稻胚乳中表达，适合于所有具有胚乳种子的植物，特别是可用于基因工程水稻表达药用蛋白水稻品种的培育；
[0034]5)本专利技术的EnhGt13本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改造的植物胚乳特异性表达启动子，具有如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5任一项所示的核苷酸序列。2.一种表达盒，含有权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子。3.一种重组表达载体，含有权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子。4.一种宿主菌，含有权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子。5.一种转基因植物或细胞系，含有权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子。6.权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子在制备基因工程植物或转基因植物中的应用。7.权利要求1所述的植物胚乳特异性表达启动子在表达任何一种重组蛋白或代谢产物的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨代常，李坤鹏，
申请(专利权)人：武汉禾元生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：