特异性抑制PTEN基因的shRNA及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种特异性抑制PTEN基因的shRNA及应用，属于基因工程和生物医药领域；在本发明专利技术中，提供了特异性抑制PTEN基因表达的shRNA序列shPTEN

【技术实现步骤摘要】
特异性抑制PTEN基因的shRNA及应用


[0001]本专利技术属于基因工程和生物医药领域，具体涉及一种特异性抑制PTEN基因的shRNA及应用。

技术介绍

[0002]卵巢癌是妇科肿瘤中常见的恶性肿瘤，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。由于卵巢癌的早期症状不明显，且目前早期诊断技术还未成熟，多数被诊断出患有卵巢癌的患者都处于中晚期状态，导致治疗及预后效果极差。卵巢癌因其不同的病理分型而需要应用不同的治疗方案，标准的治疗方案包括手术切除结合基于铂、紫杉醇的化学疗法等进行综合治疗，但常规治疗方案效果并不尽如人意，术后的复发率高达70％，且复发后肿瘤大多对常用化疗药物产生耐药性，寻求一种高效、术后复发率低且不易引起肿瘤耐药性的治疗方法与手段已成为卵巢癌治疗领域亟待解决的热点与难题之一。大量研究表明导致卵巢癌高发病率和高死亡率的主要原因是该恶性肿瘤超强的增殖特征，因此寻找一种能够有效抑制卵巢癌细胞增殖的方法，是降低卵巢癌患者术后复发率，提高患者生存率的关键。
[0003]RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）是高保守的基因防御机制，即依赖于双链RNA特异性短序列实现转录后基因沉默的技术。目前实验室常用的RNAi技术主要有siRNA寡核苷酸载体和shRNA慢病毒质粒表达载体。siRNA是短双链RNA，大小19
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29 nt左右，3
´
端有两个游离碱基，可激活RNA干扰，通过与目标mRNA互补序列结合，特异性降解mRNA。但是siRNA在细胞中的表达是瞬时的，发挥作用的时间较短。相较于siRNA，shRNA可通过病毒介导的转导保持稳定，能够减少脱靶效应。shRNA包括两个短的反向重复序列，中间由茎环结构进行分割，组成一个类似发夹的结构。shRNA首先被插入到慢病毒载体上形成重组慢病毒质粒，慢病毒质粒与其他辅助质粒借助于293FT细胞形成慢病毒，最终用慢病毒转染细胞发挥shRNA的沉默作用。在内切核酸酶Dicer作用下，shRNA被裂解成21
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25nt的核苷酸链，由正义链和反义链组成。反义链与特定的酶结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC，此复合物中含siRNA、核酸外切酶、核酸内切酶以及解旋酶等元件，核苷酸双链会被活化后的RISC解聚成为两条单链，随后反义链识别并结合与其同源的靶mRNA，在反义链的引导下活化型RISC会切割靶mRNA的特定位置，同时切割的mRNA会被RISC复合物中的酶特异性降解，从而阻断了mRNA的遗传信息传递。
[0004]PTEN是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，其编码的蛋白具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重特异性磷酸酶活性。PTEN的功能与其亚细胞定位有关。在细胞质中，PTEN可与胞质靶点相结合调节细胞增殖、细胞周期进展、细胞凋亡、细胞粘附、迁移和侵袭，并通过对PI3K/Akt信号通路的拮抗作用发挥抑癌功能；而在细胞核中，PTEN则在染色体稳定性、DNA修复、细胞周期阻滞和细胞稳定性等方面发挥重要作用。此外，PTEN还参与DNA损伤修复，尤其是双链损伤修复（double
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strand break repair，DSBR）。虽然PTEN在之前研究中都被看作抑癌基因，但近年来的研究发现，PTEN水平的降低或缺失可导致同源重组（homologous recombination，HR）缺陷。
[0005]PTEN缺失常见于胶质母细胞瘤、甲状腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌和黑色素瘤中，可显著影响癌症的发展和严重程度。大量研究表明，PTEN作为主要检查点和癌症调节剂，因此PTEN的突变和缺失与癌症的发生密切相关。由于PTEN是PI3K信号通路的拮抗因子，PTEN蛋白的表达或活性的重构可以减少PI3K介导的致癌信号，这在PTEN缺失的癌症中具有潜在的治疗价值。尽管PTEN在许多类型的癌症中扮演着重要的肿瘤抑制因子的角色，但在特定的情况下，PTEN抑制剂可能作为一种抗癌治疗新方法。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在不足，本专利技术提供了一种特异性抑制PTEN基因的shRNA及应用。在本专利技术中，通过观察沉默PTEN基因对卵巢癌细胞的影响来判断沉默PTEN基因的shRNA序列的特异性，验证了可沉默PTEN基因的shRNA序列对卵巢癌细胞生长的影响。
[0007]本专利技术中首先提供了特异性抑制PTEN基因表达的shRNA，所述shRNA为shPTEN
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1、shPTEN
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2或shPTEN
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3；其中，shPTEN
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1的序列为：F:CCGGGTCTGCCAGCTAAAGGTGAAGATATACTCGAGTATATCTTCACCTTTAGCTGGCAGACTTTTTG（SEQ.ID.NO.1）；R:AATTCAAAAAGTCTGCCAGCTAAAGGTGAAGATATACTCGAGTATATCTTCACCTTTAGCTGGCAGAC（SEQ.ID.NO.2）；所述，shPTEN
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2的序列为：F:CCGGGCCGTTACCTGTGTGTGGTGATATCACTCGAGTGATATCACCACACACAGGTAACGGCTTTTTG（SEQ.ID.NO.3）；R:AATTCAAAAAGCCGTTACCTGTGTGTGGTGATATCACTCGAGTGATATCACCACACACAGGTAACGGC（SEQ.ID.NO.4）；所述，shPTEN
‑
3的序列为：F:CCGGGAGCGTGCAGATAATGACAAGGAATACTCGAGTATTCCTTGTCATTATCTGCACGCTCTTTTTG（SEQ.ID.NO.5）；R:AATTCAAAAAGAGCGTGCAGATAATGACAAGGAATACTCGAGTATTCCTTGTCATTATCTGCACGCTC（SEQ.ID.NO.6）。
[0008]本专利技术中还提供了一种shRNA慢病毒表达载体，所述shRNA慢病毒表达载体包含上述shRNA。
[0009]本专利技术中还提供了上述shRNA或shRNA慢病毒表达载体在非治疗与诊断目的的特异性沉默卵巢癌细胞中PTEN基因中的应用。
[0010]进一步的，所述应用为使卵巢癌细胞中PTEN基因PTEN mRNA下调。
[0011]本专利技术中还提供了上述shRNA或shRNA慢病毒表达载体在制备促进卵巢癌细胞凋亡的药物中的应用。
[0012]本专利技术中还提供了一种促进卵巢癌细胞凋亡的药物，所述药物包含上述shRNA或shRNA慢病毒表达载体。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术基于PTEN基因的mRNA序列设计了3对用于构建shRNA的引物。将设计好的3
对引物分别退火，形成双链；同时将载体pLKO.1
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TRC在BamI和EcoRI酶切位点处进行酶切。分别用3种双链引物与酶切后的载体连接。连接本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性抑制PTEN基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA为shPTEN
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1、shPTEN
‑
2或shPTEN
‑
3；其中，shPTEN
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1的序列为：F:CCGGGTCTGCCAGCTAAAGGTGAAGATATACTCGAGTATATCTTCACCTTTAGCTGGCAGACTTTTTG（SEQ ID NO.1）；R:AATTCAAAAAGTCTGCCAGCTAAAGGTGAAGATATACTCGAGTATATCTTCACCTTTAGCTGGCAGAC（SEQ ID NO.2）；所述，shPTEN
‑
2的序列为：F:CCGGGCCGTTACCTGTGTGTGGTGATATCACTCGAGTGATATCACCACACACAGGTAACGGCTTTTTG（SEQ ID NO.3）；R:AATTCAAAAAGCCGTTACCTGTGTGTGGTGATATCACTCGAGTGATATCACCACACACAGGTAACGGC（SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王月，邱立鹏，屠志刚，刘晗青，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：