一种高效合成西柏三烯一醇菌株的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种高效合成西柏三烯一醇菌株的构建方法及其应用，属于代谢工程领域。所述构建方法为将西柏三烯一醇合成途径中从乙酰辅酶A到甲羟戊酸合成相关基因在酵母细胞质中表达，从IPP和DMAPP到西柏三烯一醇合成相关基因在酵母过氧化物酶体中过表达，从甲羟戊酸到IPP和DMAPP合成相关基因在细胞质或过氧化物酶体中过表达。利用该方法构建的工程菌株西柏三烯一醇产量显著提高。本发明专利技术构建的基因工程菌株经过9天发酵后西柏三烯一醇产量可达1391.3mg

【技术实现步骤摘要】
一种高效合成西柏三烯一醇菌株的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种高效合成西柏三烯一醇菌株的构建方法及其应用，属于代谢工程领域。

技术介绍

[0002]在全球杀虫剂市场的背景下，化学合成的活性化合物，如人造除虫菊衍生物和新烟碱类(如吡虫啉、噻虫嗪和噻虫胺；价值18.9亿美元)，其可快速作用害虫但非目标判别产品。新烟碱类是通过与烟碱乙酰胆碱受体不可逆结合而介导所有昆虫神经毒性作用的主要杀虫剂类别。化学农药具有诸多缺点，例如：易造成环境污染、目标种群逐渐养成抗药性、其对非目标种群具有负面性等。因此，这些化合物会影响害虫以及蜜蜂和熊蜂等有益昆虫，从而对农村地区的农作物和生物多样性的授粉产生负面影响。化学杀虫剂甚至危及工业农业活动和仍在增长的人口的可持续性。此外，这些化学品的生物降解性很差，导致环境积累，对陆地和水生生态系统的生物多样性产生负面影响。新烟碱类的广泛环境影响最近引发欧洲委员会严格限制这些化合物在农业活动中的适用性。
[0003]生物农药亦称为天然农药，是来自天然的化学物质或者生命体，具有杀菌农药和杀虫农药的作用。相比而言，生物农药具有诸多优点：选定的天然杀虫化合物对脱靶昆虫无毒、确保仅对农业活动和作物产量产生积极影响、对人畜安全、对生态环境影响小、诱发害虫患病、可利用农副产品加工生产、易被陆地微生物或光迅速降解、不会积累等。我国生物农药类型主要包括微生物农药、植物源农药、农用抗生素、天敌昆虫农药、生物化学农药、植物生长调节剂类农药等六大类型。西柏三烯一醇作为一种重要的二萜类化合物，是植物的分泌物成分，代表植物防御昆虫、病原微生物和食草动物的主要成分，在生物防治方面具有重要作用与意义。西柏三烯一醇只能在植物中以痕量检测到，但其具有显著的杀虫活性，且在自然降解过程中不会在生态圈中积累。
[0004]同时，西柏三烯一醇也是烟草中香味物质之一，对于烟草的品质具有重要影响与作用意义。虽然近年来西柏三烯一醇受到了一定关注，但相关报道与数据较少。西柏三烯一醇可以从植物中提取获得，但由于其在植物中只能以痕量检测到，含量较少。所以，通过从植物中提取的方法获得西柏三烯一醇具有一定的挑战，且生产成本太高，不利于其在农业生产中的应用。西柏三烯一醇具有复杂的化学结构又难以化学合成。因此，利用微生物生物合成西柏三烯一醇具有很大的前景及价值。目前虽然有可生产西柏三烯一醇的工程菌株，但是产量并不高。
[0005]因此，如何构建高产西柏三烯一醇的工程菌株，在提高西柏三烯一醇产量的同时降低西柏三烯一醇的生产成本仍需进一步研究。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术通过基因工程手段系统构建高效生产西柏三烯一醇的工程菌株，显著增加西柏三烯一醇的产量，提高其合成效率，促进其在农业及烟草等领域中的
应用。并且，本专利技术还提供了一种构建高效合成二萜类化合物酵母工程菌株的方法。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供了重组热带假丝酵母，所述重组热带假丝酵母以热带假丝酵母ATCC20336或热带假丝酵母CU
‑
206为宿主细胞。热带假丝酵母CU
‑
206是以热带假丝酵母ATCC20336进行改造制备得到的，其构建方法记载于文献“Lihua Zhang,et al.2020,A CRISPR
–
Cas9 system for multiple genome editing and pathway assembly in Candida tropicalis.Biotechnol Bioeng,117:531
‑
542”中。所述重组热带假丝酵母的基因组上整合了西柏三烯一醇合成途径基因：
[0009]所述西柏三烯一醇合成途径中从乙酰辅酶A到甲羟戊酸合成相关基因(包括乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、HMG
‑
CoA合成酶基因ERG13和HMG
‑
CoA还原酶基因tHMGR)在酵母细胞质中表达；所述基因ERG10的genebank登录号为：D13470.1，所述基因ERG13的genebank登录号为：RCK66100.1，所述基因tHMGR的genebank登录号为：RCK56388.1。
[0010]从IPP和DMAPP到西柏三烯一醇合成相关基因(包括香叶基/法尼基焦磷酸合酶基因ERG20、GGPP合成酶基因BTS1、和截短的西柏三烯一醇合酶基因tCBTS1)在酵母过氧化物酶体中过表达；所述基因ERG20的genebank登录号为：RCK67668.1，所述基因BTS1的genebank登录号为：RCK64891.1；所述基因tCBTS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]从甲羟戊酸到IPP和DMAPP合成相关基因(包括甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、二磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG19和异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI1)在细胞质或过氧化物酶体中过表达；所述基因ERG12的genebank登录号为：RCK63831.1，所述基因ERG8的genebank登录号为：RCK59297.1，所述基因ERG19的genebank登录号为：RCK60630.1，所述基因IDI1的genebank登录号为：RCK59267.1。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述过表达的基因通过同源重组整合到酵母染色体DNA上稳定表达，所述基因在酵母染色体上整合的拷贝数为2
‑
6。
[0013]本专利技术提供了一种合成西柏三烯一醇的基因表达盒，所述基因表达盒自上游至下游依次包括一个或多个“启动子
‑
目的基因
‑
转录终止子”结构单位；
[0014]其中，所述目的基因包括：
[0015]从乙酰辅酶A到甲羟戊酸合成的相关基因：ERG10基因、ERG13基因、tHMGR基因；或将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至各基因的3
’
端的ERG10
‑
ePTS基因、ERG13
‑
ePTS基因、tHMGR
‑
ePTS基因；
[0016]从甲羟戊酸到IPP和DMAPP合成的相关基因：ERG12基因、ERG8基因、ERG19基因和IDI1基因；或将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至各基因的3
’
端的ERG12
‑
ePTS基因、ERG8
‑
ePTS基因、ERG19
‑
ePTS基因和IDI1
‑
ePTS基因；
[0017]从IPP和DMAPP到西柏三烯一醇合成的相关基因：tCBTS1基因、ERG20基因和BTS1基因；或将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至各基因的3
’
端的tCBTS1
‑
ePTS基因、ERG2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成西柏三烯一醇的基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒自上游至下游依次包括一个或多个“启动子
‑
目的基因
‑
转录终止子”结构单元；其中，所述目的基因包括：从乙酰辅酶A到甲羟戊酸合成的相关基因：ERG10基因、ERG13基因、tHMGR基因；或将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至各基因的3
’
端的ERG10
‑
ePTS基因、ERG13
‑
ePTS基因、tHMGR
‑
ePTS基因；从甲羟戊酸到IPP和DMAPP合成的相关基因：ERG12基因、ERG8基因、ERG19基因和IDI1基因；或将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至各基因的3
’
端的ERG12
‑
ePTS基因、ERG8
‑
ePTS基因、ERG19
‑
ePTS基因和IDI1
‑
ePTS基因；从IPP和DMAPP到西柏三烯一醇合成的相关基因：tCBTS1基因、ERG20基因和BTS1基因；或将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ePTS分别连接至各基因的3
’
端的tCBTS1
‑
ePTS基因、ERG20
‑
ePTS基因和BTS1
‑
ePTS基因。2.如权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所述表达盒包括：采用P
GAP1
启动子和T
ENO1
终止子过表达ERG10基因，采用P
GAP1
启动子和T
7syn
终止子过表达tHMGR基因，及采用P
FBA1
启动子和T
PGK1
终止子过表达ERG13基因，命名为细胞质表达盒1C；将ePTS分别连接至ERG10、ERG13、tHMGR基因的3
’
端后，采用P
GAP1
启动子和T
ENO1
终止子过表达ERG10
‑
ePTS基因，采用P
GAP1
启动子和T
7syn
终止子过表达tHMGR
‑
ePTS基因，及采用P
FBA1
启动子和T
PGK1
终止子过表达ERG13
‑
ePTS基因，命名为过氧化物酶体表达盒1P；采用P
GAP1
启动子和T
ENO1
终止子过表达IDI1基因，采用P
FBA1
启动子和T
ADH2
终止子过表达ERG19基因，采用P
GAP1
启动子和T
7syn
终止子过表达ERG8基因，及采用P
FBA1
启动子和T
PGK1
终止子过表达ERG12基因，命名为细胞质表达盒2C；将ePTS分别连接至ERG12、ERG8、ERG19、IDI1基因的3
’
端后，采用P
GAP1
启动子和T
ENO1
终止子过表达IDI1
‑
ePTS基因，采用P
FBA1
启动子和T
ADH2
终止子过表达ERG19
‑
ePTS基因，采用P
GAP1
启动子和T
7syn
终止子过表达ERG8
‑
ePTS基因，及采用P
FBA1
启动子和T
PGK1
终止子过表达ERG12
‑
ePTS基因，命名为过氧化物酶体表达盒2P；采用P
GAP1
启动子和T
7syn
终止子过表达ERG20基因，采用P
FBA1
启动子和T
ADH2
终止子过表达BTS1基因，及采用P
GAP1
启动子和T
ENO1
终止子过表达tCBTS1基因，命名为细胞质表达盒3C；将ePTS分别连接至tCBTS1、ERG20、BTS1基因的3
’
端后，采用P
GAP1
启动子和T
7syn
终止子过表达ERG20
‑
ePTS基因，采用P
FBA1
启动子和T
ADH2
终止子过表达BTS1
‑
ePTS基因，及采用P
GAP1
启动子和T
ENO1
终止子过表达tCBTS1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张利华，陈献忠，夏媛媛，杨海泉，沈微，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：