一种靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术药物领域，尤其涉及一种靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体及其制备方法和应用。本发明专利技术的免疫脂质体由单克隆抗体、治疗药物和纳米脂质体组成，以抗铜绿假单胞菌的单克隆抗体为靶向剂，以环丙沙星为治疗药物，以纳米脂质体为载体。本发明专利技术提供的免疫脂质体可以赋予广谱抗生素靶向性，将抗生素富集到细菌附近，提高感染部位的局部药物浓度，避免细菌耐药性的产生。本发明专利技术提供的免疫脂质体能够减少抗生素的用药剂量，提高感染性疾病的疗效。疗效。疗效。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物技术药物领域，特别是一种靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种常见的革兰氏阴性杆状细菌，能够引起植物及动物包括人类的感染，临床上铜绿假单胞菌感染是患有癌症，囊性纤维化和烧伤等患者的严重并发症之一，死亡率高。除此之外，铜绿假单胞菌还能引起多种其他感染，包括心内膜炎、肺炎和泌尿道感染，以及中枢神经系统、伤口、眼睛、耳朵、皮肤和肌肉骨骼系统感染等。铜绿假单胞菌是医院感染的主要原因，每年影响200多万患者，每年造成约9万人死亡。铜绿假单胞菌的耐药机制包括表达抗生素失活酶、外排系统、入侵宿主细胞形成胞内菌、形成生物被膜等。
[0003]针对抗生素耐药铜绿假单胞菌，研究人员也一直在积极寻找新型的抗生素替代疗法，包括阻断或中和毒素产生、调整菌群失调、应用疫苗或抗体、抗微生物多肽及采用具有免疫调节功能的细胞因子等。在所有新型疗法中，单克隆抗体对单一种类的细菌具有很高的靶标特异性，因此不会破坏微生物群，具有安全高效的特点。脂质体是研究最广泛的纳米制剂之一，具有良好的生物相容性和可修饰性，在药物递送方面有广泛的应用。
[0004]免疫脂质体即在纳米脂质体表面修饰具有靶向作用的靶向剂，如单克隆抗体。免疫脂质体能选择性的将包埋的药物浓集定位于靶组织、靶器官或靶细胞；相比普通脂质体，免疫脂质体具有毒性更低，靶向性更强等优点。结合单克隆抗体的靶向性，以脂质体作为抗生素药物载体，可以有效提高感染部位抗生素的局部浓度，避免细菌耐药性的产生，并有利于减小全身给药剂量，降低毒副作用。免疫脂质体有望成为对抗多药耐药菌感染等严重性感染性疾病的有效治疗策略。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种同时载荷抗铜绿假单胞菌药物和抗铜绿假单胞菌单克隆抗体的免疫脂质体来解决现有药物治疗铜绿假单胞菌所致的严重感染性疾病毒副作用大、容易产生细菌耐药性的问题。
[0006]为达到此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]本专利技术第一方面提供一种靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体，所述免疫脂质体包括抗铜绿假单胞菌单克隆抗体、抗铜绿假单胞菌药物和纳米脂质体；通过负载抗铜绿假单胞菌药物的纳米脂质体与抗铜绿假单胞菌单克隆抗体共价偶联形成。
[0008]进一步地，所述抗铜绿假单胞菌单克隆抗体为靶向铜绿假单胞菌PcrV蛋白的单克隆抗体。优选地，所述抗铜绿假单胞菌单克隆抗体为靶向铜绿假单胞菌(III型分泌系统)的PcrV蛋白的单克隆抗体1F3HL。
[0009]进一步地，所述抗铜绿假单胞菌药物为环丙沙星。
[0010]进一步地，所述纳米脂质体包括磷脂、胆固醇(CHOL)和辅料。
[0011]在本专利技术的一些实施例中，所述负载抗铜绿假单胞菌药物的纳米脂质体中药物浓度为1～5mg/mL。
[0012]在本专利技术的一些实施例中，所述免疫脂质体的平均粒径为100～200nm。
[0013]在本专利技术的一些实施例中，所述免疫脂质体的抗铜绿假单胞菌药物包封率大于80％。
[0014]在本专利技术的一些实施例中，所述免疫脂质体中抗铜绿假单胞菌单克隆抗体的偶联率大于95％。
[0015]在本专利技术的一些实施例中，所述环丙沙星与纳米脂质体中磷脂的摩尔比为0.1～0.5:1，在该比例下，可实现环丙沙星包封率>80％。
[0016]在本专利技术的一些实施例中，所述抗铜绿假单胞菌单克隆抗体与纳米脂质体中磷脂含量的摩尔比为1:100～1000。
[0017]在本专利技术的一些实施例中，所述磷脂选用氢化大豆卵磷脂(HSPC)。
[0018]在本专利技术的一些实施例中，所述辅料选用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
–
聚乙二醇(DSPE
‑
PEG)，优选为DSPE
‑
PEG
2000
；对脂质体表面进行聚乙二醇(PEG)修饰后可以延长脂质体的半衰期和提高其在血液循环中的稳定性、改变脂质体的生物学分布，DSPE
‑
PEG
2000
的长循环效果较好。
[0019]在本专利技术的一些实施例中，所述纳米脂质体中HSPC与CHOL的质量比为0.1～1.0:1。
[0020]在本专利技术的一些实施例中，所述纳米脂质体中HSPC与DSPE
‑
PEG
2000
的质量比为0.1～1.0:1。
[0021]本专利技术第二方面提供一种靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0022]步骤一、将空白脂质体与抗铜绿假单胞菌药物混合孵育，得到载药纳米脂质体；
[0023]步骤二、将抗铜绿假单胞菌单克隆抗体与连接脂质混合反应，得到单克隆抗体脂质共聚物；
[0024]步骤三、将步骤一所得载药纳米脂质体与步骤二所得单克隆抗体脂质共聚物共孵育，得到靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体。
[0025]在本专利技术的一些实施例中，步骤一中所述混合孵育时间为20～40min。
[0026]在本专利技术的一些实施例中，步骤一中混合孵育后还需用10％蔗糖溶液透析，去除游离的抗铜绿假单胞菌药物。
[0027]在本专利技术的一些实施例中，步骤二中所述连接脂质为DSPE
‑
PEG
2000
‑
NHS。
[0028]在本专利技术的一些实施例中，步骤二中所述混合反应具体为4℃混合过夜反应。
[0029]在本专利技术的一些实施例中，步骤二中混合反应后还需透析去除未反应的DSPE
‑
PEG
2000
‑
NHS。
[0030]在本专利技术的一些实施例中，步骤三中共孵育后还需用10mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)缓冲液透析纯化，去除未插入的抗铜绿假单胞菌单克隆抗体及单克隆抗体脂质共聚物。
[0031]在本专利技术的一些实施例中，步骤一中所述空白脂质体的制备方法包括以下步骤：
[0032]S1、先将胆固醇溶于乙醇，然后按质量配比加入磷脂和辅料，待溶解后加入硫酸铵溶液，进行水合反应，得到水合产物；
[0033]S2、将步骤S1所得的水合产物通过脂质体挤出仪制备得到脂质体混悬液；
[0034]S3、将步骤S2所得脂质体混悬液透析，得到空白脂质体。
[0035]进一步地，步骤S1中所述磷脂与胆固醇的质量比为0.1～1.0:1。
[0036]进一步地，步骤S1中所述磷脂与所述辅料的质量比为0.1～1.0:1。
[0037]进一步地，步骤S1中所述水合反应时间为20～40min。
[0038]进一步地，步骤S1中所述硫酸铵溶液的pH为5.0～6.0，优选pH为5.5。
[0039]进一步地，步骤S3中透析所用的溶液为10％蔗糖溶液。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体，其特征在于，所述免疫脂质体包括抗铜绿假单胞菌单克隆抗体、抗铜绿假单胞菌药物和纳米脂质体；通过负载抗铜绿假单胞菌药物的纳米脂质体与抗铜绿假单胞菌单克隆抗体共价偶联形成。2.如权利要求1所述的靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体，其特征在于，还包括如下特征中的一项或几项：(1)所述抗铜绿假单胞菌单克隆抗体为靶向铜绿假单胞菌PcrV蛋白的单克隆抗体；(2)所述抗铜绿假单胞菌药物为环丙沙星；(3)所述纳米脂质体包括磷脂、胆固醇和辅料；(4)所述负载抗铜绿假单胞菌药物的纳米脂质体中药物浓度为1～5mg/mL；(5)所述免疫脂质体的平均粒径为100～200nm；(6)所述免疫脂质体的抗铜绿假单胞菌药物包封率大于80％；(7)所述免疫脂质体中抗铜绿假单胞菌单克隆抗体的偶联率大于95％。3.如权利要求2所述的靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体，其特征在于，还包括如下特征中的一项或几项：1)所述环丙沙星与纳米脂质体中磷脂的摩尔比为0.1～0.5:1；2)所述抗铜绿假单胞菌单克隆抗体与纳米脂质体中磷脂含量的摩尔比为1:100～1000；3)所述磷脂选用氢化大豆卵磷脂；4)所述辅料选用二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
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聚乙二醇。4.如权利要求3所述的靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体，其特征在于，还包括以下特征中的一项或几项：(
ⅰ
)所述纳米脂质体中氢化大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为0.1～1.0:1；(
ⅱ
)所述纳米脂质体中氢化大豆卵磷脂与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺
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聚乙二醇的质量比为0.1～1.0:1。5.一种靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、将空白脂质体与抗铜绿假单胞菌药物混合孵育，得到载药纳米脂质体；步骤二、将抗铜绿假单胞菌单克隆抗体与连接脂质混合反应，得到单克隆抗体脂质共聚物；步骤三、将步骤一所得载药纳米脂质体与步骤二所得单克隆抗体脂质共聚物共孵育，得到靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体。6.如权利要求5所述的靶向铜绿假单胞菌的免疫脂质体的制备方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或几项：(a)步骤一中所述混合孵育时间为20～40min；(b)步骤一中混合孵育后还需用10％蔗糖溶液透析，去除游离的抗铜绿假单胞菌药物；(c)步骤二中所述连接脂质为DSPE

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧，陈代杰，路慧丽，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：