本发明专利技术公开了一种高效表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻稻谷的制备方法及从表达人糜蛋白酶原的基因工程稻谷制备重组人糜蛋白酶的方法。将高效表达经水稻密码子优化的人糜蛋白酶原基因的基因工程稻谷加工粉碎后与提取缓冲液混合，提取过滤后得到含重组人糜蛋白酶原的粗提取物；将含重组人糜蛋白酶原的粗提取物经过阳离子交换层析和阴离子交换层析，获得重组人糜蛋白酶原纯化目标物。该重组人糜蛋白酶原用胰蛋白酶激活，冷冻干燥后获得重组人糜蛋白酶。该方法操作简单，无动物源性材料，获得的糜蛋白酶纯度和活性高，成本低，易于工业化放大。放大。
【技术实现步骤摘要】
一种利用基因工程水稻表达人糜蛋白酶原和制备重组人糜蛋白酶的方法
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及以基因工程水稻为生物反应器，表达人糜蛋白酶原和制备重组人糜蛋白酶的方法。
技术介绍
[0002]糜蛋白酶(Chymotrypsin)也叫胰凝乳蛋白酶，属于丝氨酸蛋白酶家族，能专一性水解芳香族氨基酸羧基形成的肽键。糜蛋白酶原由胰腺分泌，随胰液进入小肠后，在Arg15和Ile16之间(按Bovine chymotrypsin A序列编号)被胰蛋白酶切为通过二硫键连接的两部分，随后糜蛋白酶在Leu13酶切去短肽Ser14-Arg15，在Tyr146和Asn148酶切去短肽Tyr147-Asn148，形成由二硫键相连的三条多肽链并具有生物活性。
[0003]糜蛋白酶在临床上具有广泛的用途，药理作用是分解蛋白质，促进血凝块、脓性分泌物和坏死组织等清除，主要用于眼科手术以松弛睫状韧带，减轻创伤性虹膜睫状体炎；也可用于创口或局部炎症，以减少局部分泌和水肿。
[0004]由于糜乳蛋白酶能消化各种蛋白质，因而在其他表达体系表达时，会导致宿主细胞的维系生命的蛋白质降解，导致现有表达体系表达量不高。因此，现有糜蛋白酶制备依然从牛或者猪的胰脏中提取，经分级盐析后先制成糜蛋白酶原，经胰蛋白酶激活后，再用硫酸铵、乙醇重结晶精制而得。该工艺提取特异性差，操作时间长，收率低。从牛或者猪的胰脏中提取的糜蛋白酶，其氨基酸序列与人糜蛋白酶和牛源糜蛋白酶的氨基酸同源性为82％，与猪源糜蛋白酶的氨基酸序列同源仅为43％。现有动物源糜蛋白酶不仅存在引入动物源性病毒的风险，还会因异源蛋白进入人体后可能会引起免疫反应，这大大增加了用药的安全风险。
[0005]人糜蛋白酶原为一条含有263个氨基酸的肽链，在体内激活过程中首先通过信号肽到达胞外，信号肽经肽酶水解后蛋白分子所含氨基酸数变为245，即糜蛋白酶原。当糜蛋白酶原被运输到小肠后才会被胰蛋白酶激活形成活性形式。
[0006]无动物源性和人源化的生物制品是目前生物医药行业的发展趋势。从1982年第一个无动物源性的重组人胰岛素替代从动物胰脏中提取，到2008年第一个无血浆制品重组凝血酶上市，再到2020年第一个无动物源性植物源重组人血清白蛋白在美国完成1期临床研究。研发无动物源性和人源化的糜蛋白酶符合生物药物的发展趋势。
[0007]国内外目前尚没有重组人糜蛋白酶的医药产品上市。专利CN104342423A公开了一种高活性重组人糜蛋白酶的制备方法和应用，该方法是采用大肠杆菌表达重组人糜蛋白酶的包涵体，经变性和复性处理后，通过离子交换色谱层析获得较高纯度的重组人糜蛋白酶。
技术实现思路
[0008]本专利技术利用水稻胚乳细胞生物反应器来高效表达重组人糜蛋白酶原，从基因工程水稻稻谷中提取和纯化重组人糜蛋白酶原，然后通过激活获得具有生物活性的重组人糜蛋
白酶。
[0009]本专利技术的一个目的是在基因工程水稻稻谷中提供一种高效表达重组人糜蛋白酶原的方法，包括以下步骤：
[0010](1)合成如SEQ ID NO.1所示的经水稻密码子优化的人糜蛋白酶原基因序列；
[0011](2)构建水稻胚乳细胞特异性表达的重组人糜蛋白酶原表达载体；
[0012](3)将步骤2所获得载体转化到水稻品种的愈伤再生组织中；
[0013](4)培养上述愈伤再生组织，经筛选和诱导获得转重组人糜蛋白酶原基因工程水稻植株；
[0014](5)培养重组人糜蛋白酶原基因工程水稻植株，获得重组人糜蛋白酶原基因工程水稻稻谷。
[0015]其中重组人糜蛋白酶原表达载体优选具有如图3所示的结构。
[0016]本专利技术的另一个目的是提供一种从重组人糜蛋白酶原基因工程稻谷中制备重组人糜蛋白酶的方法，包括如下步骤：
[0017]提取、纯化重组人糜蛋白酶原的方法，包括以下步骤：
[0018](1)从重组人糜蛋白原基因工程水稻稻谷中提取含有重组人糜蛋白酶原的粗提取物；
[0019](2)将含有重组人糜蛋白原的粗提取物经Unigel 80SP阳离子交换层析，得到初级产物；
[0020](3)将初级产物经Unigel 80Q阴离子交换层析，得到纯化的重组人糜蛋白酶原；
[0021]将上述纯化后的重组人糜蛋白酶原经胰蛋白酶激活，冷冻干燥后，获得重组人糜蛋白酶。
[0022]进一步的，提取、纯化重组人糜蛋白酶原的方法方法包含以下步骤：
[0023]1)将重组人糜蛋白酶原基因工程稻谷脱壳加工成半精米，研磨成80～100目的米粉。将米粉与提取缓冲液以1：5(重量/体积，kg/L)的比例混合，于4～30℃提取1～16h后加入2～5％的珍珠岩压滤，滤液再经0.22μm滤膜过滤后即为重组人糜蛋白酶原的粗提取物。所述提取缓冲液的成分为：4.44～69.66g/L十二水合磷酸氢二钠、0.58～19.71g/L一水合柠檬酸，pH 2.5～8.0。
[0024]2)采用阳离子层析介质进行初级分离纯化，阳离子层析介质包括SP Bestrose FF(博格隆(上海)生物技术有限公司)、Unigel 80SP(苏州纳微科技股份有限公司)、Unigel 80CM(苏州纳微科技股份有限公司)、Unigel MMC 50S(苏州纳微科技股份有限公司)。优选使用Unigel 80SP层析介质。在一种实施方式中，采用4～6倍柱体积(CV)的pH为3.0～3.5的磷酸氢二钠-柠檬酸的缓冲液，以300～600cm/h的线性流速平衡层析柱；以步骤1)的粗提取物为上样液，其中上样液pH为3.0～3.5，上样体积不超过74CV；用5～10倍柱体积、pH为3.5～4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，以300～600cm/h的线性流速进行杂质蛋白的洗脱；用pH 3.9～4.1、含100～200mM氯化钠的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，以300～600cm/h的线性流速进行重组人糜蛋白酶原的洗脱，收集含有重组人糜蛋白酶原的洗脱液，获得含重组人糜蛋白酶原的初级产物；
[0025]3)采用阴离子层析介质进行精度纯化，阴离离子层析介质包括Unigel 80Q(苏州纳微科技股份有限公司)、NanoGel 50Q(苏州纳微科技股份有限公司)、MMA-50S(苏州纳微
科技股份有限公司)、Q Bestrose FF(博格隆(上海)生物技术有限公司)、Unigel 30Q(苏州纳微科技股份有限公司)、Q Bestrose HP(博格隆(上海)生物技术有限公司)。优选使用Unigel 80Q层析介质。采用10～15倍柱体积的pH 7.9～8.1，电导1.5～2.0mS/cm的磷酸氢二钠-柠檬酸的缓冲液，以382～840cm/h的流速平衡柱子；将步骤2)的含重组人糜蛋白酶原的洗脱液用5～10kDa超滤膜包(聚醚砜材质)适当浓缩，并用pH 7.9～8.1，电导1.5～2.0mS/cm的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液透析至电导降低至1.5～2.5mS/cm，调节pH至7.9～8.1，作为此步层析本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高效表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻稻谷的制备方法，包括以下步骤：(1)合成具有如SEQ ID NO.1所示序列的经水稻密码子优化的人糜蛋白酶原基因；(2)将步骤(1)的人糜蛋白酶原基因，与水稻特异性启动子Gt13a及其信号肽导入质粒载体构建水稻胚乳细胞特异性表达的人糜蛋白酶原表达载体；(3)将步骤(2)获得的载体转化到水稻品种的愈伤再生组织中；(4)培养所述愈伤再生组织，经筛选和诱导获得表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻植株；(5)培育所述表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻植株，获得表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻稻谷。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述质粒载体为pOsPMP801，具有如图3所示的结构。3.一种利用表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻稻谷制备重组人糜蛋白酶的方法，包括以下步骤：(1)从表达人糜蛋白酶原基因工程水稻稻谷中提取含有重组人糜蛋白酶原的粗提取物；(2)将所述含有重组人糜蛋白酶原的粗提取物经阳离子交换层析，得到初级产物；(3)将所述初级产物经阴离子交换层析，得到纯化的重组人糜蛋白酶原；(4)将所述纯化的重组人糜蛋白酶原经胰蛋白酶激活，冷冻干燥后，获得重组人糜蛋白酶；该方法获得纯度95％的重组人糜蛋白酶；其中所述表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻稻谷按照权利要求1所述的方法制备。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述重组人糜蛋白酶原粗提取物是通过下述方法制备：1)将重组人糜蛋白酶原基因工程稻谷脱壳加工成半精米，研磨成80～100目的米粉；2)将上述米粉与提取缓冲液按1∶5的重量/体积比混合，单位为kg/L；4～30℃下提取1～16小时；所述提取缓冲液的成分为：4.44～69.66g/L十二水合磷酸氢二钠、0.58～19.71g/L一水合柠檬酸，pH 2.5～8.0；3)将步骤2)的提取混合物，入2％～5％的珍珠岩压滤，滤液再经0.22μm滤膜过滤后即为重组人糜蛋白酶原的粗提取物。5.根据权利要求4所述的方法，所述重组人糜蛋白酶原的提取缓冲液为pH2.5～3.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，提取时间为1～2h，提取温度为20～30℃。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述阳离子交换层析介质为SP Bestrose FF、Unigel 80SP、Unigel 80CM、或Unigel MMC 50S。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述阳离子层析介质为Unigel 80SP。8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述重组人糜蛋白酶原初级产物是通过下述方法制备：1)采用4～6倍柱体积CV的pH为3.0～3.5...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨代常，董亮亮，李坤鹏，尹恒，
申请(专利权)人：武汉禾元生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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