一种利用基因工程水稻表达人糜蛋白酶原和制备重组人糜蛋白酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻稻谷的制备方法及从表达人糜蛋白酶原的基因工程稻谷制备重组人糜蛋白酶的方法。将高效表达经水稻密码子优化的人糜蛋白酶原基因的基因工程稻谷加工粉碎后与提取缓冲液混合，提取过滤后得到含重组人糜蛋白酶原的粗提取物；将含重组人糜蛋白酶原的粗提取物经过阳离子交换层析和阴离子交换层析，获得重组人糜蛋白酶原纯化目标物。该重组人糜蛋白酶原用胰蛋白酶激活，冷冻干燥后获得重组人糜蛋白酶。该方法操作简单，无动物源性材料，获得的糜蛋白酶纯度和活性高，成本低，易于工业化放大。放大。

【技术实现步骤摘要】
一种利用基因工程水稻表达人糜蛋白酶原和制备重组人糜蛋白酶的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及以基因工程水稻为生物反应器，表达人糜蛋白酶原和制备重组人糜蛋白酶的方法。

技术介绍

[0002]糜蛋白酶(Chymotrypsin)也叫胰凝乳蛋白酶，属于丝氨酸蛋白酶家族，能专一性水解芳香族氨基酸羧基形成的肽键。糜蛋白酶原由胰腺分泌，随胰液进入小肠后，在Arg15和Ile16之间(按Bovine chymotrypsin A序列编号)被胰蛋白酶切为通过二硫键连接的两部分，随后糜蛋白酶在Leu13酶切去短肽Ser14-Arg15，在Tyr146和Asn148酶切去短肽Tyr147-Asn148，形成由二硫键相连的三条多肽链并具有生物活性。
[0003]糜蛋白酶在临床上具有广泛的用途，药理作用是分解蛋白质，促进血凝块、脓性分泌物和坏死组织等清除，主要用于眼科手术以松弛睫状韧带，减轻创伤性虹膜睫状体炎；也可用于创口或局部炎症，以减少局部分泌和水肿。
[0004]由于糜乳蛋白酶能消化各种蛋白质，因而在其他表达体系表达时，会导致本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻稻谷的制备方法，包括以下步骤：(1)合成具有如SEQ ID NO.1所示序列的经水稻密码子优化的人糜蛋白酶原基因；(2)将步骤(1)的人糜蛋白酶原基因，与水稻特异性启动子Gt13a及其信号肽导入质粒载体构建水稻胚乳细胞特异性表达的人糜蛋白酶原表达载体；(3)将步骤(2)获得的载体转化到水稻品种的愈伤再生组织中；(4)培养所述愈伤再生组织，经筛选和诱导获得表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻植株；(5)培育所述表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻植株，获得表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻稻谷。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)所述质粒载体为pOsPMP801，具有如图3所示的结构。3.一种利用表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻稻谷制备重组人糜蛋白酶的方法，包括以下步骤：(1)从表达人糜蛋白酶原基因工程水稻稻谷中提取含有重组人糜蛋白酶原的粗提取物；(2)将所述含有重组人糜蛋白酶原的粗提取物经阳离子交换层析，得到初级产物；(3)将所述初级产物经阴离子交换层析，得到纯化的重组人糜蛋白酶原；(4)将所述纯化的重组人糜蛋白酶原经胰蛋白酶激活，冷冻干燥后，获得重组人糜蛋白酶；该方法获得纯度95％的重组人糜蛋白酶；其中所述表达人糜蛋白酶原的基因工程水稻稻谷按照权利要求1所述的方法制备。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述重组人糜蛋白酶原粗提取物是通过下述方法制备：1)将重组人糜蛋白酶原基因工程稻谷脱壳加工成半精米，研磨成80～100目的米粉；2)将上述米粉与提取缓冲液按1∶5的重量/体积比混合，单位为kg/L；4～30℃下提取1～16小时；所述提取缓冲液的成分为：4.44～69.66g/L十二水合磷酸氢二钠、0.58～19.71g/L一水合柠檬酸，pH 2.5～8.0；3)将步骤2)的提取混合物，入2％～5％的珍珠岩压滤，滤液再经0.22μm滤膜过滤后即为重组人糜蛋白酶原的粗提取物。5.根据权利要求4所述的方法，所述重组人糜蛋白酶原的提取缓冲液为pH2.5～3.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，提取时间为1～2h，提取温度为20～30℃。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述阳离子交换层析介质为SP Bestrose FF、Unigel 80SP、Unigel 80CM、或Unigel MMC 50S。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述阳离子层析介质为Unigel 80SP。8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述重组人糜蛋白酶原初级产物是通过下述方法制备：1)采用4～6倍柱体积CV的pH为3.0～3.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨代常，董亮亮，李坤鹏，尹恒，
申请(专利权)人：武汉禾元生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：