BCR-ABL 融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种BCR-ABL融合蛋白突变体编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，还提供了包含该核苷酸序列的表达载体及其构建方法；还提供了一种BCR-ABL融合蛋白突变体，该突变体是基于BCR-ABL/c-ABL SH3结构域位点突变而设计，位于ABL SH3结构79位的苏氨酸突变为酪氨酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。构建的BCR-ABL融合蛋白突变体竞争性结合RIN1，直接阻滞和减少胞内RIN1与BCR-ABL的结合，联合IM作用，进而增加细胞对IM的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡，同时克服了直接敲除RIN1基因引发的潜在并发症。

【技术实现步骤摘要】
BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体及其构建方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体及其构建方法，还涉及该BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体在治疗慢性粒细胞白血病中的应用。
技术介绍
BCR-ABL融合蛋白具有异常激活的酪氨酸激酶活性，是慢性粒细胞白血病(Chronicmyelogenousleukemia，CML)的典型标志，大于90％的CML病人表达BCR-ABL融合基因，而正常细胞中不表达BCR-ABL融合蛋白，且ABL位于胞核，RIN1主要定位胞浆。位于ABL段的SH3结构与BCR-ABL蛋白激酶活性激活有着直接的关系，可负向调控BCR-ABL的活性，其关键位点的突变或结合配体的改变均可引起伊马替尼(Imatinib，IM)耐药。酪氨酸激酶抑制剂IM，在CML的治疗中有可喜的成效，是治疗CML的里程碑，但是由于BCR-ABL激酶区T315I突变等原因，造成临床15％-20％病人对IM耐药，给CML的治疗带来一定困难，因此，解决IM耐药的问题已经成为CML研究的热点之一。研究发现，RIN1蛋白——Ras抑制因子1，是ABL的一个直接的激活因子并且控制对IM敏感的调定点。该蛋白通过自身富含脯氨酸的序列(PPAVPPPPVP)与ABL的SH3(PxxPmotif)高特异性低亲和力的结合，降低细胞对IM的敏感性，且RIN1与BCR-ABL的结合不受T315I突变的影响，亦不受除SH3、SH2和TKD以外的Abl结构域的影响。不同的慢性粒细胞白血病细胞株中RIN1蛋白的表达不同，这种表达的不同影响细胞株对IM的敏感性。例如，耐药慢粒细胞株KCL22高表达RIN1蛋白，而对IM敏感的细胞株中RIN1表达较低，而K562细胞表达较低对IM敏感。目前，关于RIN1在CML方面的研究，主要包括：1.RNA干扰或者基因敲除后，和/或联合IM，分析ABL激酶活性、ABL磷酸化底物水平的变化以及相关的信号通路的研究；2.利用RIN1ABD结构域靶向结合ABL的功能，在RIN1蛋白上连接有功能的酶、核定位信号等功能片段，或者基因突变该结构，从而达到抑制ABL酪氨酸激酶活性的目的。以上方法，不能直接阻抑RIN1和BCR-ABL的结合，且RIN1在不同的细胞中表现不同的生理功能，如在乳腺细胞中RIN1是抑癌基因，因此敲掉后可能会诱发乳腺癌的发生。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体及其构建方法。本专利技术的另一目的是提供该BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体在治疗慢性粒细胞白血病中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的一种BCR-ABL融合蛋白突变体编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示：AACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACTATCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCA本专利技术还提供了含有所述核苷酸序列SEQIDNO:1的表达载体。所述表达载体为将所述的核苷酸序列SEQIDNO:1插入穿梭质粒pAd-Track-CMV后与骨架质粒pAd-Easy-1重组得到。本专利技术还提供了构建所述含有核苷酸序列SEQIDNO:1的表达载体的方法，包括如下步骤：(1)采用重叠延伸PCR方法进行扩增得到核苷酸序列SEQIDNO:1的片段，包括三个反应体系：PCR1，PCR2和PCR3；PCR1以野生型ABLSH3为模板，上下游引物为F/Rm3；PCR2以野生型ABLSH3为模板，上下游引物为R/Fm3；PCR3以PCR1和PCR2的反应产物作为模板，上下游引物为F/R；所述引物序列为：F:5'-GCGTCGACAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATT-3',R:5'-CCGCTCGAGTCATGGCGTGATGTAGTTGCTTGG-3',Rm3:5'-ATTCCCCATTGTGAATATAGCCTAAGACCC-3,Fm3:5'-GTGGAGATAACtatCTAAGCATAACTAA-3'；(2)将步骤1得到的核苷酸序列为SEQIDNO:1的片段和穿梭质粒pAd-Track-CMV经限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接构建重组质粒；(3)将步骤2得到的重组质粒经EcoRI酶切后与骨架质粒pAd-Easy-1连接构成重组腺病毒载体。本专利技术还提供了BCR-ABL融合蛋白突变体，所述的突变体是基于BCR-ABL/c-ABLSH3结构域位点突变而设计，位于ABLSH3结构79位的苏氨酸突变为酪氨酸，所述BCR-ABL融合蛋白突变体氨基酸序列为SEQIDNO:2，其序列为：NLFVALYDFVASGDNYLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGWVPSNYITP更进一步地，本专利技术还提供了：所述的核苷酸序列SEQIDNO:1在制备多种治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用；含有核苷酸序列SEQIDNO:1的表达载体在制备多种治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用；氨基酸序列为SEQIDNO:2的BCR-ABL融合蛋白突变体在制备多种治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过计算机模拟构建基于BCR-ABL/c-ABLSH3结构域位点突变的BCR-ABL融合蛋白突变体结构，设计该突变体编码基因的引物扩增得到目的基因片段，构建了含有编码该BCR-ABL融合蛋白突变体基因序列的表达载体。构建的BCR-ABL融合蛋白突变体竞争性结合RIN1，直接阻滞和减少胞内RIN1与BCR-ABL的结合，联合IM作用，进而增加细胞对IM的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡，同时克服了直接敲除RIN1基因引发的潜在并发症。肿瘤细胞中，构建的BCR-ABL融合蛋白突变体，直接封闭RIN1与BCR-ABL结合的结构域，不影响其他结合域，有利于RIN1其他生物学功能的发挥；该突变体与RIN1的作用，不受T315I突变的影响，克服了单纯使用IM时，T315I突变引起的耐药。本专利技术为CML治疗和解决耐药问题奠定了小分子基础，提供了新的选择。附图说明图1为突变体M3结构示意图。图2为重组腺病毒载体构建示意图。图3为免疫共沉淀验证M3和RIN1的相互作用。图4为Westernblot检测突变体M3单独作用CML细胞株的有效性；图4A为对KCL22细胞作用，图4B为对K562/G01细胞作用，图4C为对K562细胞作用。图5为M3联合IM作用对CML细胞增殖的影响；图5A为对KCL22细胞增殖的影响，图5B为对K562细胞增殖的影响。图6为流式细胞术检测细胞凋亡。图7为流式细胞术检测细胞周期。图8为突变体M3联合IM作用CML细胞株对BCR-ABL及底物磷酸化水平、BCR-ABL下游信号通路相关蛋白的表达的影响。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种BCR‑ABL融合蛋白突变体编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种BCR‐ABL融合蛋白突变体编码基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种含有权利要求1所述核苷酸序列的表达载体。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为将权利要求1所述的核苷酸序列插入穿梭质粒pAd‐Track‐CMV后与骨架质粒pAd‐Easy‐1重组得到。4.一种构建权利要求2或3所述的表达载体的方法，其特征在于：该构建方法包括如下步骤：(1)采用重叠延伸PCR方法进行扩增得到核苷酸序列SEQIDNO:1的片段，包括三个反应体系：PCR1，PCR2和PCR3；PCR1以野生型ABLSH3为模板，上下游引物为F/Rm3；PCR2以野生型ABLSH3为模板，上下游引物为R/Fm3；PCR3以PCR1和PCR2的反应产物作为模板，上下游引物为F/R；所述引物序列为：F:5'‐GCGTCGACAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATT‐3',R:5'‐CCGCTCGAGTCATGGCGTGATGTAGTTGCTTGG‐3',Rm3...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯文莉，刘鑫，文良雪，黄峥兰，李会，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85