一种快速检测鹅掌楸属植物花蜜中单糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测鹅掌楸属植物花蜜中单糖的方法，属于化学分析领域。与利用高效液相色谱检测植物花蜜成分的传统方法相比，本方法具有快速、高效、进样量少、低成本的特点。本发明专利技术利用α-萘胺衍生法，以pH9.5、Na2B4O7·10H2O水溶液为背景缓冲液，在20kv电压，0.5psi进样8s的条件下，20min即可分离花蜜中葡萄糖、果糖；采用外标法测定葡萄糖、果糖的含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化学分析
，具体是利用毛细管电泳法分离并检测鹅掌楸属植 物花蜜中葡萄糖和果糖的含量。
技术介绍
木兰科鹅掌楸属（Liriodendron)植物现存2个种，一种是北美鹅掌楸 (L.tulipiferaLinn.);另一种为鶴掌楸〔L.chinense(Hemsl.)Sarg.〕。鶴掌楸属花两性， 呈杯状，与叶同时开放或稍后开放；花被片9,外轮萼片3片绿色，向外开展；内两轮花瓣6 片直立。鹅掌楸与北美鹅掌楸花颜色相差很大，鹅掌楸花黄绿色，近基部有黄色纵条纹，而 北美鹅掌楸花翠绿色，近基部有橙黄色或橙红色色带。鹅掌楸与北美鹅掌楸的花蜜分泌量 差异也很大，北美鹅掌楸单日花蜜分泌量为ml级，而鹅掌楸单日花蜜分泌量为ul级。因此， 在北美洲，北美鹅掌楸为重要的蜜源植物。 Muller(1883)、Faegri和vanderPijl(1966)认为植物花蜜是吸引昆虫传份的 重要诱物之一，也是研宄植物与昆虫协同进化的重要材料。植物花蜜中含有许多昆虫所需 的营养物质，而糖类是其中最重要也是含量最高的营养物质。研宄表明，花蜜中的多糖主要 是蔗糖，单糖主要是葡萄糖及果糖，而对于那些开放式花朵的植物，己糖在花蜜的糖类中的 比率占主导性位置。因此花蜜中糖类的检测分析对于探讨植物繁殖生态学的研宄有着重大 的意义。但是由于一般植物花蜜分泌量一般只有ul?ml级，并且含有大量的脂类，酚类等 有机小分子物质。而传统的化学分析检测方法检出限高，操作复杂，耗时长。 对于单糖的分析，在采用高效液相色谱分析时，因为糖类本身在紫外区域基本没 有吸收峰，而且也无荧光。所以一般采用示差折光检测器检测。但示差折光检测器灵敏度 低，检出限仅为l〇_6g/l水平级。而且高效液相色谱本身具有分析时间长，样品用量大，糖柱 成本高的缺点。如果采用气相色谱法测定，由于单糖的沸点较高，难以气化，需要先转化为 挥发性的衍生物才可以进行测定。 近年来，利用毛细管电泳仪检测各类生物分子（核酸、蛋白质、糖类）成为一种新 的选择。毛细管电泳具有分离效率高、分析时间短、进样量少、检测限低和多模式等特点。随 着毛细管电泳技术的不断完善，以及检测手段的多样化，应用毛细管电泳技术分离各类生 物分子也逐渐增多。但迄今为止，还未有利用毛细管电泳技术分离、检测植物花蜜中单糖种 类与含量的报道。 目前，常用的毛细管电泳仪检测器有UV检测器、LIF检测器，以及PAD检测器。其 中，UV检测器具有价格低廉、适用性广、操作简便的优点，是应用最广的毛细管电泳仪检测 器。适用于UV检测器的单糖的检测方法一般分为：衍生反应后直接测定法，不经衍生化反 应直接测定和间接测定。而最常用的是衍生反应后直接测定。对于还原性单糖，衍生反应 大都基于还原氨基化反应，也就是分子的还原端与带电的发色或荧光基团的伯胺反应成为 希夫氏碱，再利用硼氰氢化钠还原成仲胺，常用的方法有2-氨基吡啶法、CBQA〔3-(4_羧 基甲酰基）_2_喹啉甲醛〕法、PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）法、ANTS(8-氨基、苯 基-1，3, 6-三磺酸）法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是利用毛细管电泳快速分离检测鹅掌楸属植物花蜜 中的葡萄糖和果糖的含量。该方法克服了以往采用的高效液相色谱法所具有的手段复杂， 分析时间长，样品需求量大的缺点，而且大大节省了检测成本。 为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下： 将花蜜样品采用滤膜过滤后，在水浴锅内进行衍生化处理，然后利用毛细管电泳 仪分离样品中葡萄糖和果糖，并用UV检测器定性检测，最后使用外标法对葡萄糖和果糖进 行定量。 其中，所述的滤膜，其孔径为〇. 45ym。 其中，在水浴锅内进行衍生化处理的方法为：将滤液和衍生试剂按照体积比 1:1?5:1 (优选5:1)混合，密封后在60?80°C(优选80°C)水浴锅内水浴0.5?2h(优 选lh) 〇 其中，所述的衍生试剂配方为：143. 2mga-萘胺、35mgNaBH3CN、450y1无水甲醇 和41y1冰乙酸混合，按此配方等比例放大或者缩小。 具体衍生步骤如下： (1)配制衍生液：称取143. 2mga-萘胺和35mgNaBH3CN，溶于450y1无水甲醇中， 再加入41yL冰乙酸，混匀。放入冰箱中待用。 (2)花蜜的柱前衍生：取100ul的花蜜样品，加入20ul的衍生液置于10ml离心管 中，用封口膜密封。放入80°C水浴锅中水浴lh。然后加入三氯甲烧和水各lml，充分混匀 后，10000r/min离心5min，重复3次，去上层水相待测。 其中，毛细管电泳的反应体系为：选择50umX46cm的石英毛细管（实际长度 40cm)，以pH9. 5、75mmol/l的Na2B407 ? 10H20 水溶液为背景缓冲液，0? 5psi进样 8s，UV= 214nm，20kv的电压下电泳20min〇 有益效果：本专利技术获得了一种快速分离测定花蜜中葡萄糖、果糖的方法。其优点在 于以下几个方面： 1、使用0. 45um的滤膜过滤样品，可以有效的去除新鲜花蜜中的微生物和细菌。避 免对电泳结果造成干扰。 2、如果电泳背景缓冲液pH值过低，会导致单糖分子无法正常电离，则无法得到 电泳结果。如果电泳背景缓冲液pH值过高，又会降低电泳分离度。使用pH= 9. 5的 Na2B407 ? 10H20缓冲液既可以使单糖分子正常电离，又保持了较高的分离度。 3、电压也是影响分离度的重要因子之一。高电压虽然会减低电泳时间，但是却会 降低分离度，低电压反之。使用20kv的电压既保持了高分离度，又可以快速地得到电泳结 果。 4、大幅度的缩减了样品的检测时间，从采样到获得检测结果只需2h。 5、本专利技术方法检出限为0. 028-0. 320mg/ml，精密度，重现性实验RSD均小于5%。【附图说明】 图1北美鹅掌楸花蜜毛细管电泳图像 图2鹅掌楸花蜜毛细管电泳图像【具体实施方式】 根据下述实施的实例，可以更好地理解本专利技术。实例所描述的内容仅用于说明本 专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。 实施例1 :利用毛细管电泳检测北美鹅掌楸及鹅掌楸花朵花蜜中葡萄糖、果糖含 量 (1)仪器与药品：毛细管电泳仪（BeckmanP/ACEMDQ电泳仪）、UV检测器、毛细 管、0. 45um滤膜、北美鹅掌楸花蜜、鹅掌楸花蜜（均采于江苏句容市下蜀镇南京林业大学下 蜀实习林场鹅掌楸种源试验林）、葡萄糖、果糖、Na2B407 ? 10H20、a-萘胺、NaBH3CN、甲醇、冰 乙酸（试剂均为分析纯） (2)样品前处理：将北美鹅掌楸及鹅掌楸的新鲜花蜜稀释1倍后用0. 45um滤膜过 滤，将滤液放入4°C冰箱待用。 (3)衍生试剂配制：用电子天平分别称取143. 2mga-萘胺和35mgNaBH3CN，溶于 450y1无水甲醇中，然后加入41y1冰乙酸。混匀后放入冰箱待用。 (4)衍生化处理：分别取100y1花蜜滤液，加入20y1衍生试剂置于10ml离心管 中。封口膜密封，放入80°C水浴锅中水浴lh。然后加入三氯甲烧和水各lml，充分混匀后， 10000r/min离心5min，重复3次。去上层水相定容至5ml，待测。 (5)电泳检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测鹅掌楸属植物花蜜中单糖的方法，其特征在于，将花蜜样品采用滤膜过滤后，在水浴锅内进行衍生化处理，然后利用毛细管电泳仪分离样品中葡萄糖和果糖，并用UV检测器定性检测，最后采用外标法对葡萄糖和果糖进行定量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李火根，吕剑南，石瑞，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32