一种杂交鹅掌楸LhPIN3基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种杂交鹅掌楸LhPIN3基因及其应用，该杂交鹅掌楸LhPIN3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术在建立成熟的杂交鹅掌楸体胚发生体系的基础上，克隆生长素运输蛋白基因LhPIN3，通过表达分析，证明了杂交鹅掌楸的LhPIN3基因在杂交鹅掌楸体胚发生过程中对胚性细胞发育和体胚苗生长有较大的影响，其过表达试验发现LhPIN3的过表达会影响植株的生长发育，另外LhPIN3的表达还可以部分拯救拟南芥LhPIN3基因功能完全丧失的pin1突变体，使其恢复表型，开花并结出荚果，因此可应用于植物体胚发生、不定根诱导、不定芽的诱导和分化等，具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
—种杂交鹅掌楸A/^/似基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一种杂交鹅掌楸基因及其应用。
技术介绍
20世纪生物技术在林木优良材料和新品种的发现与培育中的重要进步是体细胞胚胎发生技术及再生植株培育技术的应用。体胚发生技术由于其两极性、繁殖速度快、效率高等特点，已经成为优良林木资源快速无性繁殖的重要手段，并且它能和生物反应器结合实现大规模商业化生产。体细胞胚发生的本质是细胞分化的问题，细胞分化使体细胞发育成体细胞胚进而发育成一个完整植株。而细胞分化的分子基础则是基因差异表达与调控的结果。所以研究这些相关基因可以使我们更好的了解体细胞发生技术的原理。杂交鹅掌楸是我国著名林木遗传育种家叶培忠教授利用分布在我国的中国鹅掌歌 iLiriodendron chinensis (HemsI.)Sarg.)和分布在北美的北美鶴掌揪(Zirioofeflt/ro/?tulip if era Linn.)通过人工杂交育成的种间杂种。杂交鹅掌楸不仅具有生长快，抗性强，材质好，而且其树形美观，花色艳丽，是一种适用于庭院栽培，道路绿化，荒山荒地造林等多种用途的优良树种。杂交鹅掌楸虽然有许多优越性，但杂交制种受到季节和效率的限制，影响了杂交鹅掌楸的推广应用，由于植物体细胞胚具有数量多，一旦形成体细胞胚就能够快速发育成再生植株的特点，以体细胞胚胎发生技术快速繁殖种子来源困难的杂交鹅掌楸，具有重要的理论意义和应用价值。到目前为止，已经成功利用杂交种体细胞建立了杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生技术和快速成苗体系，开辟了杂交鹅掌楸产业化开发的新途径。在杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生体系的研究中发现，体细胞胚经过了球形胚、心形胚、鱼雷胚与子叶胚全过程，说明其发育过程与合子胚的发育完全相同，而且各个发育时期体细胞胚的形状与合子胚也非常接近。因此，在研究当中，利用体胚发生系统深入研究体细胞胚发生与发育的机制对于揭示细胞分化、发育、形态发生与胚胎发生发育过程等重大理论问题的机制，以及真核细胞中基因表达和调节控制等具有十分重要的意义。植物生长调节剂的诱导和调节是离体培养条件下体细胞转化成胚性细胞的重要诱导因子。其中，生长素是诱导体细胞胚发生的关键因素。在体细胞胚的发生和发育过程中，生长素的极性运输和组织中心细胞与干细胞的形成起关键作用，它们通过启动胚性特征基因表达，最终决定体细胞原胚的产生，进而继续发育形成成熟体细胞胚。造成这种极性运输的原因是由于在 运输生长素的细胞中生长素输出蛋白在质膜上的极性分布所致。很多研究已表明，生长素的运输蛋白在植物的胚后发育过程及植物的光形态建成和组织分化方面也起着非常重要的作用。生长素在植物组织中的极性分布很大程度上归功于高度调控、极性定位的输出载体PINs蛋白。PINs蛋白是生长素的输出载体，能使生长素从细胞内流出。PINs蛋白家族各成员间存在功能冗余，并受多水平调节。在特异组织细胞中表达的各种PIN蛋白形成一个具有相同生化功能的PIN蛋白系统，此系统组成一个灵活的生长素分布网，对植物体生长发育相关事件作出应答。PIN蛋白是决定生长素流方向的基础，为植物体的各部分和细胞提供了特异的位置信息和方向信息。所以，PIN蛋白和生长素信号转导系统共同调节植物体的生长发育。生长素的极性运输与植物的许多生长发育过程密切相关，但是生长素的调控机制有很多地方认识的都不够全面。最近几年，编码生长素运输蛋白的基因的克隆使人们对生长素极性运输的研究取得了很大的进展。截止目前为止，已经从拟南芥中至少克隆出来8个基因，在水稻、玉米等植物中也得到了数个同源基因。根据这些基因在序列上的高度保守性说明在不同植物中也许在其生长发育过程中具有相同的功能。拟南芥中的/ΥΛ7、PIN2、PIN3、PIN4、PIN7已经被证实了在植物早期胚胎发育以及根的向地性、植物的伸长生长以及植物的向性反应中都具有一定的影响。
技术实现思路
专利技术目的:针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种杂交鹅掌楸LhPim基因。本专利技术的另一目的是提供杂交鹅掌楸基因在杂种鹅掌楸育种中的应用。 技术方案:为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下: 一种杂交鹅掌楸基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述的杂交鹅掌楸LhPim基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述的杂交鹅掌楸LhPim基因在杂交鹅掌楸育种中的应用。含有杂交鹅掌楸基因的载体或宿主细胞。PINs蛋白是生长素的输出载体，能使生长素从细胞内流出。在特异组织细胞中表达的各种PIN蛋白形成一个具有相同生化功能的PIN蛋白系统，此系统组成一个灵活的生长素分布网，对植物体生长发育相关事件作出应答。拟南芥与杂交鹅掌楸的基因的过量表达都导致了植株生长缓慢、发育推迟。生长素对组织中心细胞与干细胞的形成起关键作用，通过启动胚性特征基因表达，最终决定体细胞原胚的产生，进而继续发育形成成熟体细胞胚。继而在植物的胚后发育过程及植物的光形态建成和组织分化方面也有重要的影响。有益效果:与现有技术相比，本专利技术在建立成熟的杂交鹅掌楸体胚发生体系的基础上，克隆了生长素运输蛋白基因LhPIN’3，通过表达分析，证明了杂交鹅掌楸的LhPIN3基因在杂交鹅掌楸体胚发生过程中对胚性细胞发育和体胚苗生长有较大的影响，其过表达试mhPIN3的过表达会影响植株的生长发育，别\ LhPim的表达还可以拯救拟南芥中功能完全丧失的突变体，使其恢复表型，开花并结出荚果，因此可应用于植物体胚发生、不定根诱导、不定芽的诱导和分化等，具有很好的应用前景。【附图说明】图1是杂交鹅掌楸总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图； 图2 ILhPim基因全长PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图； 图3是双酶切反应结果的1%琼脂糖凝胶电泳图； 图4是表达载体酶切验证结果的1%琼脂糖凝胶电泳图； 图5 ILhPim表达载体图；图6是不同时期的杂交鹅掌楸材料图； 图7是基因在不同时期的实时定量结果图； 图8是Tl代种子的筛选结果图； 图9是Tl、T2代阳性植株检测结果图； 图10是LhPim过表达转基因拟南芥表型图； 图11良LhPIN3mmjvpinl突变体表型图； 图12是转基因拟南芥叶片组织培养表型图。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例1 以杂交鹅掌楸为材料，提取总RNA，并反转成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，与PMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。挑取阳性克隆进行质粒抽提，加入酶切位点后与载体PBI121同时双酶切，在T4连接酶的作用下连接后，转入农杆菌GV3101中，待拟南芥适龄后，通过花器官浸泡转化法进行转化，观察Tl，T2代和T3代转基因纯合体再生植株表型。(I)总RNA的提取 以杂交鹅掌楸的侧芽为材料，按照NORGEN试剂盒(Norgen Sioid)的操作步骤进行RNA的提取，所使用的试剂和耗材均处理使其无RNA酶。杂交鹅掌楸总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，条带清晰；测定总RNA的吸光度，OD26tZOD28tl值为1.96，OD260/OD230为2.08，可见RNA质量较好。RNA提取的具体过程为:加入6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杂交鹅掌楸LhPIN3基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种杂交鹅掌楸基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.权利要求1所述的杂交鹅掌楸基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：施季森，袁梦笺，王鹏凯，李霞，陈金慧，李美平，陆叶，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32