本发明专利技术涉及病毒载体，其包括编码HIV多肽的寡核苷酸，更具体地，其中所述病毒是腺病毒。具体而言，此类腺病毒是非人类的灵长类动物腺病毒，诸如猿猴腺病毒，更具体地，黑猩猩腺病毒。具体而言，本发明专利技术涉及腺病毒载体，其包括编码多种不同HIV抗原的HIV多核苷酸序列，例如两种或三种或者更多种的HIV抗原。本发明专利技术进一步涉及制备所述病毒载体的方法，涉及由此方法制备的病毒载体，并涉及所述载体在医药，尤其是在预防性或治疗性疫苗接种方面的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒载体，包括编码HIV多肽的寡核苷酸，更具体地，其中所述病毒载体是腺病毒。具体而言，此类腺病毒是非人灵长类动物腺病毒，诸如猿猴腺病毒(simianadenovirus)，更具体地，是黑猩猩腺病毒。具体而言，本专利技术涉及包括HIV多核苷酸序列的腺病毒载体，该序列编码多种不同的HIV抗原，例如，两种或三种或者更多种HIV抗原。本专利技术进一步涉及制备所述病毒载体的方法，涉及通过本方法所制备的病毒载体，并涉及所述载体在医药，尤其是在预防性或者治疗性疫苗接种方面的用途。HIV-1是导致获得性免疫缺陷综合征(the acquired immunedef iciencysyndrome,AIDS)的主要原因，该病症被认为是世界上的主要健康问题之一。尽管在世界范围内已进行了广泛的研究，但生产疫苗的努力至今尚未获得成功。HIV-1是反转录病毒科的一种RNA病毒。HIV基因组编码至少九种蛋白，其被划分为三个种类:主要的结构蛋白Gag、Pol和Env,调控蛋白Tat和Rev,以及辅助蛋白(accessory proteins) Vpu、Vpr、Vif和Nef。HIV基因组显示了所有反转录病毒的5' LTR-gag-pol-env-LTR3'组织方式。腺病毒是一种双链DNA病毒，基因组大小大约36kb，由于其具有在多种靶组织中获得高效基因转移的能力以及巨大的转基因容量而被广泛地用于基因转移。按常规，腺病毒的El基因缺失，并用转基因盒替换，该 转基因盒由所选的启动子、感兴趣基因的cDNA序列和polyA信号组成，从而产生复制缺陷型重组病毒。腺病毒具有典型的二十面体衣壳形态，其包括三种主要的蛋白，六邻体(hexon)(II)、五邻体基底(penton base) (III)和具圆柄的纤维(IV)，以及大量的其它次要蛋白V1、VII1、IX、IIIa 和 IVa2 (Russell ff.C.2000, Gen Virol, 81:2573-2604)。该病毒的基因组是线性双链DNA，5'末端与末端蛋白共价结合，所述5'末端具有反向末端重复序列(invertedterminal repeats, ITRs)。病毒DNA与高碱性蛋白VII以及被命名为mu小肽紧密结合。另一种蛋白，V，与此DNA-蛋白复合体包装在一起，并通过蛋白VI提供了一种连接至衣壳的结构链。此病毒同样包含病毒编码的蛋白酶，其对于加工一些结构蛋白以产生出成熟的传染性病毒而言是必要的。100种以上不同血清型的腺病毒已被分离出来，其感染不同种类的哺乳动物，其中51种是人类起源的。此类人类起源的腺病毒实例为Ad1、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、AdlU Ad24、Ad34、Ad35。人类的血清型根据一些生物学、化学、免疫学和结构标准已被划分为六个亚类(A-F)[第一页，W004018627]。尽管基于Ad5的载体已在大量的基因治疗试验中被广泛地使用，但是由于自然感染而在总体人群中预先存在的免疫性，使得Ad5以及其它C组腺病毒载体的使用可能受到限制。Ad5以及其它C组成员容易成为血清阳性率最高的血清型之一。对现有载体的免疫性可能由于在治疗期间暴露于该载体而得以发展。此类对血清阳性载体的预先存在的或者发展的免疫性可能会限制基因治疗或者接种疫苗努力的功效。因此，在寻找能够规避宿主免疫反应的基因递送系统时，可选的腺病毒血清型构成了非常重要的靶标。可选血清型的一种此类范围是非人灵长类动物的腺病毒，尤其是黑猩猩腺病毒。参见美国专利6，083，716，其描述了两种黑猩猩腺病毒的基因组。已表明黑猩猩(Pan或C)腺病毒载体如同人腺病毒载体一样有效地诱导对转基因产物的强烈的免疫反应(Fitzgerald et al.J.1mmunol.170:1416)。HIV Tat和Nef蛋白是早期蛋白，即它们是在感染的早期，在缺乏结构蛋白的情况下表达。Nef基因编码一种早期的辅助性HIV蛋白，其已被表明具有若干种活性。例如，已知Nef蛋白能够引起CD4，HIV受体，从细胞表面的清除，尽管此功能的生物学重要性还有争议。此外，Nef与T细胞的信号通路相互作用并诱导了一种活化状态，此状态反过来可以促进更有效的基因表达。一些HIV分离物在此区域内具有突变，其致使它们无法编码功能蛋白并导致其在体内复制和致病过程中严重受损。Gag基因是由全长RNA翻译而来，以产生一种前体多聚蛋白，其随后被剪切成3_5种衣壳蛋白；基质蛋白、衣壳蛋白和核酸结合蛋白以及蛋白酶。(Fundamental Virology,Fields BN, Knipe DM and HowleyM 19962.Fields Virology vol 21996)。Gag基因产生出55-千道尔顿(kD)的Gag前体蛋白，也被称为p55，其由未经剪接的病毒mRNA表达。在翻译过程中，p55的N末端被豆蘧酰化，这引发了其与细胞膜胞质面的结合。膜结合的Gag多聚蛋白募集了病毒基因组RNA的两个拷贝，以及其它病毒蛋白和细胞蛋白，这引发了病毒颗粒从感染细胞的表面出芽。出芽后，在病毒成熟期间P55被病毒编码的蛋白酶(Pol基因的产物)切割为四种更小的蛋白，被命名为MA(基质matrix[pl7])、CA (衣壳 capsid[p24])、NC(核壳体 nucleocapsid[p9])和 ρ6.(4)。 除三种主要的Gag蛋白(pl7，p24and p9)之外，所有Gag前体都含有若干个其它区域，其被切割下来并作为各种大小的肽保留在病毒粒子中。这些蛋白具有不同的作用，例如P2蛋白被提出在调节蛋白酶活性方面具有作用，并且有助于对蛋白水解加工进行正确的时间选择。MA多肽来源于p55的N-端，豆蘧酰化末端。大多数MA分子保持连接于病毒粒子脂双层的内表面，使该病毒颗粒稳定。一套(subset)MA在病毒粒子更深层的内部被募集，在其中它成为复合物的一部分，该复合物护送病毒DNA至细胞核。这些MA分子促进了病毒基因组的核转运，因为MA上的亲细胞核信号被细胞的核输入机器所识别。此现象使HIV能够感染不发生分裂的细胞，对反转录病毒而言是一种不寻常的特性。p24(CA)蛋白构成病毒颗粒的圆锥形核心。亲环蛋白A(CyclophilinA)已被证实与p55的p24区域相互作用，导致其整合入HIV颗粒中。Gag与亲环蛋白A之间的相互作用是必不可少的，因为通过环孢菌素A破坏这种相互作用抑制了病毒的复制。Gag的NC区负责特异性地识别所谓HIV包装信号。该包装信号由定位于病毒RNA5'末端附近的四个茎环结构组成，并且足以介导将异源RNA整合进HIV-1病毒粒子中。NC通过由两个锌指基元介导的相互作用而结合于包装信号。NC同样有助于反转录过程。p6多肽区介导p55Gag和辅助蛋白Vpr之间的相互作用，导致Vpr被整合入装配中的病毒粒子。p6区同样含有所谓的晚期结构域(Iatedomain)，其是出芽的病毒粒子从感染细胞中有效释放所必需的。Pol基因编码三种具有病毒早期感染所需活性的蛋白，反转录酶RT、蛋白酶以及使病毒DNA整合入细胞DNA所需的整合酶蛋白。Pol的初级产物被病毒粒子的蛋白酶切割以产生氨基末端的RT肽，其含有DNA合成所需的活性(RNA和DNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种腺病毒载体，包括编码至少HIV抗原RT、Nef和Gag或者它们的免疫原性片段的一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸被如此安排以便使它们按照Gag、RT、Nef的顺序被转录，其特征在于所述病毒是E1和/或E3缺失的Pan6或Pan7腺病毒。
【技术特征摘要】
2005.05.12 US 60/6803891.一种腺病毒载体，包括编码至少Hiv抗原RT、Nef和Gag或者它们的免疫原性片段的一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸被如此安排以便使它们按照Gag、RT、Nef的顺序被转录，其特征在于所述病毒是El和/或E3缺失的Pan6或Pan7腺病毒。2.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其中所述RT是被截短的。3.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其中所述Nef是被截短的。4.根据权利要求1至3任一项所述的腺病毒载体，其中所述Gag只是pl7和p24。5.根据权利要求1至3中任一项所述的腺病毒载体，其中所述的一种或多种HIV多核苷酸的大小使得所述载体的总体大小为所述病毒大小的90至100%。6.根据权利要求1至3中任一项所述的腺病毒载体，其中编码所述HIV抗原的多核苷酸序列被安排为融合形式。7.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：PF埃尔特尔，JP蒂特，CA范维利，
申请(专利权)人：葛兰素集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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