融合至Fc结构域的抗VEGF单可变结构域制造技术

本发明专利技术涉及抗原结合构建体，其包含通过抗体的单链Fc区域分隔的一个或两个表位结合结构域，其中每个表位结合结构域能够结合至VEGF；涉及包含两个本发明专利技术的抗原结合构建体的二聚体，包含所述二聚体的药物组合物及其在治疗与VEGF信号转递相关的疾病中的用途，所述疾病例如糖尿病性黄斑水肿(DME)、湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞(RVO)和角膜新生血管形成，以及编码所述抗原结合构建体的多核苷酸序列。

An anti VEGF single variable domain fused to the Fc domain

The present invention relates to constructs comprising binding antigen, separated by single stranded Fc region antibody one or two epitope binding domains, each of which can form a binding domain binding to VEGF; two of the present invention includes two antigen binding dimer constructs, comprising the two poly pharmaceutical composition the body and its use in the treatment of diseases associated with VEGF signal transduction in the disease, such as diabetic macular edema (DME), wet age-related macular degeneration (wet AMD), diabetic retinopathy, retinal vein occlusion (RVO) and the formation of corneal neovascularization, and the antigen binding polynucleotides encoding construct sequence.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】背景生长因子的血管内皮生长因子(VEGF)家族及其受体是血管发生和血管通透性的基本调节剂。VEGF家族包括VEGF-A、PIGF(胎盘生长因子)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-E和蛇毒VEGF，并且认为每一种在血管形成模式（vascularpatterning）和血管发育中具有不同的作用。由于从8个外显子的单基因转录的mRNA的可变剪接，VEGF-A具有至少9个亚型(同种型)，其通过在信号肽剪切后剩余的氨基酸数量而确定。例如，在人中，最主要的同种型是VEGF165，其以可溶型和细胞结合型之间的平衡态存在。较长的同种型(VEGF183、VEGF189和VEGF206)具有高度带正电并介导与细胞表面的多糖以及调节其生物利用度的肝素结合的C-末端区域。所有的VEGF-A同种型都形成同二聚体，并且具有通过构成受体结合VEGF片段的大约110个N-末端残基的核心发生的结合。在正常条件下，并且在实体瘤的中心，VEGF的表达主要通过低氧条件介导，表示血管供应的短缺。低氧导致低氧诱导因子HIF-1α与组成型表达的HIF-1α的二聚化，形成结合至VEGF基因的启动子区域中的低氧响应元件的转录因子。在正常含氧量下，由于多个脯氨酸羟基化事件的结果，HIF-1α蛋白经历泛素介导的降解。其他肿瘤相关的VEGF上调由于经由通过炎性细胞因子和生长因子以及通过机械力的癌基因通路(即ras)的活化而发生。活性VEGF同二聚体通过VEGFR家族的受体结合至细胞表面。VEGF-A的主要血管内皮相关受体是VEGFR1(Flt1)和VEGFR2(Flk-2；KDR)。这两种受体都是酪氨酸激酶家族的成员，并且需要配体介导的二聚化用于活化。在二聚化后，激酶结构域经历自身磷酸化，尽管VEGFR2中的激酶活性的程度大于在VEGFR1中的激酶活性的程度。已经证实，尽管VEGF对VEGFR1的亲和力高大约3倍(KD~30pM，相比之下对VEGFR2为100pM)，但VEGF的血管生成信号传递主要通过VEGFR2介导。这导致下述提议，即VEGFR1主要充当诱饵受体以隔离VEGF并减缓VEGFR2活化的程度。尽管VEGFR1表达与一些肿瘤相关，但其主要作用看起来是在胚胎发育和器官发生期间。VEGF-A165也通过神经纤毛蛋白受体NRP1和NRP2结合。尽管这些受体缺少TK结构域，但认为它们充当VEGFR2的共同受体，并且通过将VEGF转移至VEGFR2而增强信号转递。很多研究已帮助确认VEGF-A作为肿瘤血管发生中的关键因子。例如，VEGF-A表达在大多数肿瘤中和肿瘤相关的基质中。在缺少充分发育且扩张的血管系统以支持生长的条件下，肿瘤细胞发生坏死和凋亡，从而对可由持续细胞增殖导致的肿瘤体积(1mm3的级别)的增大施加限制。VEGF-A的表达在邻近坏死区域的低氧肿瘤细胞中最高，表明在生长的肿瘤中通过低氧诱导VEGF-A能够改变血管发生的活化剂和抑制剂的平衡，导致在肿瘤中的新血管的生长。与这个假说一致，已开发出作为治疗剂的多种方法，包括小分子量酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体、反义寡核苷酸等，其抑制或捕获VEGF-A或阻断其信号转递受体VEGFR-2。VEGF-A已参与多种眼部疾病，例如年龄相关性黄斑变性(AMD)、湿性AMD、地图样萎缩、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞疾病、糖尿病性黄斑水肿和角膜血管形成。VEGF-A由多种眼部细胞类型响应低氧而产生，并且具有多种功能，包括促进血管通透性和刺激内皮细胞生长。AMD定义为视网膜色素上皮的异常，其导致黄斑中的上覆感光细胞退化，并且导致中央视觉损失。AMD代表了主要的公共健康负担，并且估计在美国，超过9百万人具有中期或晚期形式的AMD。早期AMD表征为玻璃疣和视网膜色素上皮的色素沉着或色素减退，而没有视觉损失。其中发生视觉损失的晚期AMD，可表现为地图样萎缩或脉络膜新生血管形成(CNV)。CNV，也称作湿性AMD，是血管异常生长的结果。雷珠单抗(Lucentis)、贝伐单抗(Avastin)和阿柏西普(Eylea)是抗VEGF疗法的实例，它们通常施用以用于新生血管性AMD。尽管存在这样的治疗，但仍需要用于治疗AMD和其他眼部疾病的进一步的疗法。专利技术概述本专利技术涉及抗原结合构建体，其包含通过抗体的单链Fc区域分隔的一个或两个表位结合结构域，其中每个表位结合结构域都能够结合至VEGF。一方面，本专利技术的抗原结合构建体的每个表位结合结构域是域抗体，也称作dAb。在进一步的方面，本专利技术涉及以下抗原结合构建体：a)DOM15-26-597–AS–Fc(SEQIDNo.110)–纤连蛋白x4–DT02-K-044-085；或b)DOM15-26-597–IgG1铰链–Fc(SEQIDNo.110)–纤连蛋白x4–DT02-K-044-085；或c)(a)或(b)的变体，其在整个序列上具有至少97%的氨基酸同一性；或d)(a)或(b)的变体，其中每条dAb序列与特异的dAb的序列具有至少97%的序列同一性。本专利技术进一步涉及包含两个本专利技术的抗原结合构建体的二聚体，包含所述二聚体的药物组合物，及其在治疗与VEGF信号转递相关的疾病中的用途，所述疾病例如糖尿病性黄斑水肿(DME)、湿性年龄相关性黄斑变性(湿性AMD)、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉阻塞(RVO)、和角膜新生血管形成，以及编码所述抗原结合构建体的多核苷酸序列。附图图1：ELISA，和EC50值，其显示了结合至人VEGF165的DMS1529、DMS1576和贝伐单抗(Avastin)的比较。图2A：通过MSD，在使用3ug/mLVkFc-dAbDMS30000预饱和后，VhdAb-FcDMS1576与VEGF的结合。图2B：通过MSD，在使用3ug/mLVhdAb-FcDMS1576预饱和后，VkFc-dAbDMS30000与VEGF的结合。图3：对于来自与贝伐单抗(Avastin)相比的抗VEGFVhdAb-Fc、VkFc-dAb和dAb-Fc-dAb分子的VEGF诱导的人脐带内皮细胞(HUVEC)增殖测定的最大抑制的加权方差分析。图4：通过MSD，DMS1529和DMS30000对小鼠VEGF164的结合。专利技术详述本专利技术涉及抗原结合构建体，其包含通过抗体的单链Fc区域分隔的两个表位结合结构域，其中每个表位结合结构域能够结合至VEGF。一方面，本专利技术的抗原结合构建体的每个表位结合结构域是域抗体，也称作dAb。如本文使用的术语“表位结合结构域”是指独立于不同的可变区域或结构域而特异性地结合抗原或表位的结构域。这可以是域抗体(dAb)，或者它可以是作为支架的衍生物的结构域，所述支架选自CTLA-4(Evibody)；脂质运载蛋白；蛋白A衍生的分子，例如蛋白A的Z-结构域(Affibody，SpA)、A-结构域(Avimer/Maxibody)；热激蛋白，例如GroEl和GroES；转铁蛋白(trans-body)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C-型凝集素结构域(四连接素(T本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗原结合构建体，其包含通过抗体的单链Fc区域分隔的两个表位结合结构域，其中每个表位结合结构域能够结合至VEGF。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.07.27 US 61/5121381.抗原结合构建体，其包含通过抗体的单链Fc区域分隔的两个表位结合结构域，其中每个表位结合结构域能够结合至VEGF。
2.权利要求1的抗原结合构建体，其中每个表位结合结构域是域抗体（dAb）。
3.权利要求2的抗原结合构建体，其中一个dAb连接至所述单链Fc区域的N-末端，且另一个dAb连接至所述单链Fc区域的C-末端。
4.权利要求3的抗原结合构建体，其中连接至所述单链Fc区域的N-末端的所述dAb是重链dAb。
5.权利要求3的抗原结合构建体，其中连接至所述单链Fc区域的N-末端的所述dAb是轻链dAb。
6.权利要求3-5中任一项的抗原结合构建体，其中连接至所述单链Fc区域的C-末端的所述dAb是轻链dAb。
7.权利要求5或权利要求6的抗原结合构建体，其中所述轻链dAb是κ或λ轻链dAb。
8.权利要求2-7中任一项的抗原结合构建体，其中每个dAb独立地选择且包含与DOM15-26-593、DOM15-26-597、DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255的序列至少90%相同的氨基酸序列。
9.权利要求2-8中任一项的抗原结合构建体，其中每个dAb独立地选择且包含与DOM15-26-593、DOM15-26-597、DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255的序列至少97%相同的氨基酸序列。
10.权利要求2-9中任一项的抗原结合构建体，其中每个dAb独立地选自：DOM15-26-593、DOM15-26-597、DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236和DT02-K-044-255。
11.权利要求3-10中任一项的抗原结合构建体，其中连接至所述单链Fc区域的N-末端的所述dAb包含与DOM15-26-597或DT02-K-044-085的序列至少90%相同的氨基酸序列。
12.权利要求3-11中任一项的抗原结合构建体，其中连接至所述单链Fc区域的N-末端的所述dAb包含与DOM15-26-597或DT02-K-044-085的序列至少97%相同的氨基酸序列。
13.权利要求11或权利要求12的抗原结合构建体，其中连接至所述单链Fc区域的N-末端的所述dAb是DOM15-26-597或DT02-K-044-085。
14.权利要求3-13中任一项的抗原结合构建体，其中连接至所述单链Fc区域的C-末端的所述dAb包含与DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255的序列至少90%相同的氨基酸序列。
15.权利要求3-14中任一项的抗原结合构建体，其中连接至所述单链Fc区域的C-末端的所述dAb包含与DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255的序列至少97%相同的氨基酸序列。
16.权利要求14或权利要求15的抗原结合构建体，其中连接至所述单链Fc区域的C-末端的所述dAb是DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255。
17.权利要求16的抗原结合构建体，其中连接至所述单链Fc区域的C-末端的所述dAb是DT02-K-044-085。
18.权利要求2-7中任一项的抗原结合构建体，其中每个dAb独立地选择并且包含：
viii)CDR序列SEQIDNo.111、112和113中的一个或多个；
ix)CDR序列SEQIDNo.114、115和116中的一个或多个；
x)CDR序列SEQIDNo.117、118和119中的一个或多个；
xi)CDR序列SEQIDNo.120、121和122中的一个或多个；
xii)CDR序列SEQIDNo.123、124和125中的一个或多个；
xiii)CDR序列SEQIDNo.126、127和128中的一个或多个；或
xiv)CDR序列SEQIDNo.129、130和131中的一个或多个。
19.权利要求18的抗原结合蛋白，其中连接至抗体的Fc区域的N-末端的所述dAb包含一个或多个CDR序列SEQIDNo.114、115和116，且连接至抗体的Fc区域的C-末端的所述dAb包含一个或多个CDR序列SEQIDNo.117、118和119。
20.抗原结合构建体，其包含连接至抗体的单链Fc区域的一个表位结合结构域，其中所述表位结合结构域是包含与DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255的序列至少90%相同的氨基酸序列的dAb，并且进一步地其中所述表位结合结构域能够结合至VEGF。
21.抗原结合构建体，其包含连接至抗体的单链Fc区域的一个表位结合结构域，其中所述表位结合结构域是包含与DT02-K-044-085、DT02-K-044-251、DT02-K-044-232、DT02-K-044-236或DT02-K-044-255的序列至少97%相同的氨基酸序列的dAb，并且进一步地其中所述表位结合结构域能够结合至VEGF。
...

【专利技术属性】
技术研发人员：C阿什曼，IR卡奇波尔，Z休格斯托马斯，AP路易斯，M斯蒂沃德，
申请(专利权)人：葛兰素集团有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB