具有降低的与抗药物抗体结合的经修饰的单可变结构域抗体制造技术

本发明专利技术涉及经修饰的蛋白质和肽，其具有降低的与预存抗体结合的能力。此类经修饰的蛋白质/肽分子可以包含C末端添加、延伸或标签和/或某些氨基酸取代。此类经修饰的分子（例如融合物和缀合物）包含蛋白质、肽、抗原结合分子、抗体或抗体片段例如单可变结构域，例如人免疫球蛋白（抗体）单可变结构域，以及来源于非人来源例如美洲驼或骆驼的单可变结构域，例如VHH，包括nanobody™（尤其例如WO 94/04678和WO 95/04079中所描述的）。本发明专利技术进一步涉及包含此类经修饰的C末端延伸的和/或氨基酸取代的分子的用途、制剂、组合物，以及还涉及这些分子的生产和表达方法。

Modified single variable domain antibodies with reduced anti drug antibodies.

The present invention relates to modified proteins and peptides, which have a reduced ability to bind pre existing antibodies. Such modified protein / peptide molecules can contain C terminal addition, elongation or labelling and / or certain amino acid substitutions. Such modified molecules (such as fusion and conjugates) contain proteins, peptides, antigen binding molecules, antibodies, or antibody fragments, such as a single variable domain, such as a single variable domain of Human Immunoglobulin (antibody), and a single variable domain derived from a nonhuman source such as a camel or camel, such as VHH, a package. It includes nanobody e (especially for example, WO 94/04678 and WO 95/04079). The invention further relates to the use, preparation, composition, and the production and expression of these molecules, including the molecules that extend and / or amino acids that are extended by the modified C terminal.

【技术实现步骤摘要】
具有降低的与抗药物抗体结合的经修饰的单可变结构域抗体本申请是以下申请的分案申请：申请日：2012年8月13日；申请号：201280051150.4(PCT/EP2012/065782)；专利技术名称：同上。本专利技术涉及经修饰的蛋白质和肽，其具有降低的与预存抗体结合的能力。此类经修饰的蛋白质/肽分子可以包含C末端添加、延伸或标签和/或某些氨基酸取代。此类经修饰的蛋白质/肽分子（包括其融合物和缀合物）可以包含抗原结合分子，例如抗体、抗体片段和单可变结构域，例如人免疫球蛋白（抗体）单可变结构域，以及来源于非人来源例如美洲驼或骆驼的单可变结构域，例如VHH，包括Nanobody™（尤其例如如WO94/04678和WO95/04079中所描述的）。本专利技术进一步涉及包含此类经修饰的C末端延伸的和/或氨基酸取代的分子的用途、制剂、组合物，以及还涉及这些分子的生产和表达方法。专利技术背景在人中存在可以与蛋白质例如与宿主免疫球蛋白或免疫球蛋白片段结合的天然发生的自身抗体，例如类风湿因子（其结合抗体的Fc区中的表位）、抗独特型自身抗体（其结合抗体可变区/CDR区）和抗铰链自身抗体（其结合Fab片段中的Ig恒定结构域的铰链区）。这些自身抗体可以是抗免疫球蛋白（Ig）自身抗体的多克隆所有组成成分（repertoire）的部分，并对于遍及存在于人和非人灵长类动物中的Ig分子的表位具有特异性。除结合完整Fc结构域（即类风湿因子（RF））内的表位的抗IgG自身抗体之外，已观察到与IgG的可变CDR区结合的抗独特型自身抗体以及与Fab或F（‘Ab’）2片段的C末端铰链区中的隐藏表位反应的抗铰链抗体的存在。这些不同抗IgG自身抗体的功能作用仍不确定。类风湿因子和抗铰链自身抗体已与某些病理学状况例如自身免疫以及某些感染联系，而抗独特型抗体可以赋予保护免受某些自身免疫疾病中的自身抗体。此外，已提出关于抗IgG自身抗体的免疫调节作用，其中这些自身抗体控制自体反应性B细胞的刺激且调节针对外来抗原的免疫应答。抗铰链抗体是与切割的而不是完整的IgG反应的抗IgG自身抗体。它们在正常人群中的高流行率暗示先前对IgG片段的暴露，可能是作为通过细菌或内源蛋白酶的IgG切割的结果。除了与内源蛋白质（首次用于实验的个体中存在的）结合，自身抗体还可以与施用于个体用于治疗的蛋白质或肽结合。与施用于个体的分子例如治疗蛋白质和肽结合的预存抗体可以影响其功效，并且通过维持、消除或中和该分子，可以在治疗患者中导致施用反应、超敏反应、改变的临床应答以及改变的生物利用度。然而，在一些情况下，这些抗体的存在在药物治疗过程中可以比在其他情况下更不显著。结合治疗性蛋白质的自身抗体和响应药物治疗（例如治疗性蛋白质或肽的施用）新近形成的抗体统称为抗药物抗体（ADA）。当ADA在本文件各处描述时，除非另有具体说明，我们指的是预存ADA。VH和VL域抗体来源于完全人构架序列，并且尽管在计算机芯片上的预测描述了明显低的潜在免疫原性肽的发生率，但可能这些域抗体在人中可以是免疫原性的，即它们可以引发ADA，并且它们可以与预存ADA结合，这取决于序列依赖性和序列不依赖性因子两者。类似地，来源于骆驼科（Camelid）重链（VHH）的许多单dAb处于临床研究下，并且虽然仍未报道超敏反应或其他免疫介导的不利事件，但与预存ADA结合的可能性依然存在。因此提供用于治疗的分子可以是有利的，所述分子包含蛋白质或肽，例如抗原结合分子，当施用于个体特别是人个体时，其具有降低的与预存ADA结合的能力）。专利技术概述如本文描述的，我们已证实在来自一些健康的首次用于实验的人个体的血清中，存在可以结合VH域抗体和VHH分子的预存抗VH自身抗体，以及可以结合VL分子的抗VL（例如Vκ（VK））自身抗体。结合VHdAb的预存ADA类似于抗铰链抗体，因为它们结合IgG片段，而不是在完整IgG上原位发现的那些相同序列。如本文描述的开发了特异性免疫测定，并且验证以在人中检测针对VHdAbDOM1H-131-206（SEQIDNO1中所示的氨基酸序列）的抗药物抗体。在测定中筛选一组60个健康人供体血清样品的本底反应性。测定来自这些个体的大约45%血清样品具有可检测的抗体，其能够与DOM1H-131-206结合。这个反应性看起来对于VHdAb构架序列内的一个或多个新表位是特异性的，因为应答与结合多种靶抗原的dAb的VH构架交叉反应，但不与全人IgG交叉反应。针对VLdAb的预存ADA也在来自健康人供体的血清样品中观察到，但程度低于VH。采取诱变方法，我们测定对VH构架的修饰是否能够降低这些预存ADA的结合。使用这种方法，我们定位到针对VHdAb构架的C末端的表位，并且我们例示了可以用于降低或消除预存抗体与VL、VH和VHH分子结合的许多方法。特别地，我们已显示改变dAbC末端的三维构象的修饰，特别是VH和VHHdAb中的C末端丝氨酸残基（即在Kabat第113位处）的修饰是重要的。另外，通过添加进一步的氨基酸残基（C末端延伸）和/或通过取代在VHdAb中的第14、41、108、110和112位中的一个或多个处存在的氨基酸残基，可以改变dAbC末端的三维构象。本专利技术因此提供了经修饰的分子，与未经修饰的分子相比较，其具有降低的与（预存）ADA结合的能力，并且适合于施用于个体例如人个体用于治疗或预防。降低的结合能力意指该分子以降低的亲和力（affinity）或降低的亲合力（avidity）与预存ADA结合。此类分子包含蛋白质或肽例如抗原结合蛋白质，例如抗体、抗体片段和单可变结构域，例如人免疫球蛋白（抗体）单可变结构域（VH或VL），以及来源于非人来源例如美洲驼或骆驼的单可变结构域，例如骆驼科VHH，包括Nanobody™（尤其例如WO94/04678和WO95/04079中所述的）。所述分子包含选自下述的一种或多种修饰：（a）C末端添加、延伸、缺失和/或标签，和/或（b）一个或多个氨基酸构架取代。此外，本文描述的经修饰的分子和包含这些经修饰的分子的药物组合物可以具有增强的安全性概况，和比未经修饰的分子例如未经修饰的dAb更少的副作用，以降低预存ADA结合，所述未经修饰的分子不包含C末端延伸、添加、缺失或标签和/或其他构架修饰。类似地，本文描述的经修饰的分子或包含这些经修饰的分子的药物组合物（其具有降低的与预存ADA结合的能力）的施用可以导致经修饰的免疫原性，并且还可以导致改进的功效和改进的安全性概况，并且例如可以有利地用于给患者重复给药，所述患者可以发生针对未经修饰的分子例如dAb的自身抗体。因此，在本专利技术的第一个方面，提供：单免疫球蛋白可变结构域（dAb），其包含选自下述的一种或多种修饰：（a）C末端延伸，其包含一个氨基酸到5个氨基酸的氨基酸延伸；或（b）一个或多个氨基酸构架取代，其中至少一个取代是选自下述的取代：P14A取代、P41A取代和L108A取代。在一个实施方案中，提供了从一到4个氨基酸的C末端延伸。在另一个实施方案中，所述C末端延伸包含其为丙氨酸的氨基酸，并且与未经修饰的单免疫球蛋白可变结构域（dAb）相比较，其具有降低的与预存ADA的结合。在另一个方面，C末端延伸可以是1-15个氨基酸，例如1-8个氨基酸，或1、1-2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.单免疫球蛋白可变结构域（dAb），其包含选自下述的一种或多种修饰：（a）C末端延伸，其包含从1个氨基酸至5个氨基酸的氨基酸延伸；或（b）一个或多个氨基酸构架取代，其中至少一个取代是选自下述的取代：P14A取代、P41A取代和L108A取代；并且与未经修饰的单免疫球蛋白可变结构域（dAb）相比，其具有降低的与预存ADA的结合。

【技术特征摘要】
2012.07.25 EP PCT/EP2012/064632;2011.12.12 GB 11211.单免疫球蛋白可变结构域（dAb），其包含选自下述的一种或多种修饰：（a）C末端延伸，其包含从1个氨基酸至5个氨基酸的氨基酸延伸；或（b）一个或多个氨基酸构架取代，其中至少一个取代是选自下述的取代：P14A取代、P41A取代和L108A取代；并且与未经修饰的单免疫球蛋白可变结构域（dAb）相比，其具有降低的与预存ADA的结合。2.根据权利要求1的单免疫球蛋白可变结构域（dAb），其中所述dAb选自人VH、或人VLdAb或骆驼科VHH。3.根据权利要求1或2的单免疫球蛋白可变结构域（dAb），其包含从1个氨基酸至4个氨基酸的C末端延伸。4.根据前述权利要求中任一项的单免疫球蛋白可变结构域（dAb），其中所述C末端延伸包含其为丙氨酸的氨基酸。5.根据前述权利要求中任一项的单免疫球蛋白可变结构域（dAb），其中（i）当所述单免疫球蛋白可变结构域是人VH或骆驼科VHH时，所述C末端延伸包含选自下述的氨基酸延伸或由其组成：（a）A、（b）AS、（c）AST、（d）ASTK、（e）ASTKG、（f）AAA或（g）T；和（ii）当所述单免疫球蛋白可变结构域是人VL例如Vκ时，所述C末端延伸包含选自下述的氨基酸延伸或由其组成：（a）AAA、（b）A、（c）TV和（d）T。6.单免疫球蛋白可变结构域（dAb...

【专利技术属性】
技术研发人员：C阿什曼，M伯赫勒，RMT德维尔特，C霍兰，AP刘易斯，P摩利，T桑达尔，M斯图尔德，
申请(专利权)人：葛兰素集团有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB