能够中和具有替换凝固因子VIII(FVIII)的功能的活性的物质的抗体制造技术

本发明专利技术的发明专利技术人尝试制备中和具有在功能上替换FVIII的活性的物质的活性的抗体，所述抗体用于在具有在功能上替换FVIII的活性的物质存在下测量FVIII的反应性的方法。结果，发明专利技术人发现通过使用所制备的抗体，通过基于APTT的一步凝固测定可以准确地评估血友病A患者的血浆中的FVIII活性，并且还发现可以通过基于APTT的Bethesda测定准确地评估携带FVIII抑制剂的血友病A患者的血浆中的FVIII抑制剂滴度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】能够中和具有替换凝固因子VIII(FVIII)的功能的活性的物质的抗体
本专利技术涉及抗体，所述抗体用于在具有在功能上替换凝固因子VIII(FVIII)的活性的物质存在下测量FVIII的反应性的方法。
技术介绍
血友病是由FVIII或凝固因子IX(FIX)的先天性缺陷或功能障碍造成的出血性疾病。前者被称作血友病A，后者被称作血友病B。这两个基因都位于X染色体上；且由于它们是X-染色体-连锁的隐性遗传的遗传异常，发生该疾病的那些人中的99％或更多是男性。已知的是，流行率是10,000个男性出生中的大约1个，且血友病A和血友病B之间的比率是大约5∶1。血友病患者中的主要出血部位包括关节内、肌肉内、皮下、口内、颅内、消化道、鼻内等。在它们中，重复的关节内出血可以发展成伴有关节障碍和行走困难的血友病性关节病，其最终可能需要关节置换。因此，它是降低血友病患者的生活质量(QOL)的一个主要因素。血友病的严重程度与血液中的FVIII活性或FIX活性非常相关。具有小于1％的凝固因子活性的患者被归类为严重的，具有1％或更多至小于5％的活性的患者被归类为中等的，且具有5％或更多且小于40％的活性的患者被归类为轻度的。具有严重征状的患者(占血友病患者的大约一半)一个月几次地表现出出血征状(如果他们不接受以后描述的预防性替代疗法)，并且该频率与中等症状的患者和轻度症状的患者的频率相比明显更高。除了血友病和获得性血友病以外，已知由vonWillebrand因子(vWF)的功能异常或缺乏造成的血管性血友病(vonWillebrand'sdisease)是一种有关的出血异常。vWF不仅是血小板在血管壁的损伤部位处发生向内皮下组织的正常粘附所必需的，而且它也是与FVIII形成复合物并将血液中的FVIII保持在正常水平所必需的。在血管性血友病患者中，这些功能下降，从而导致止血功能障碍。为了预防和/或治疗血友病患者中的出血，主要使用从血浆纯化的血液凝固因子或通过基因工程技术产生的那些。在严重的血友病患者中，认为通过FVIII或FIX替代疗法将血液中的FVIII活性或FIX活性维持在1％或更多对于预防出血征状的出现而言是有效的(非专利文献1、2)。另一方面，在血友病患者、特别是严重的血友病患者中，可能产生针对FVIII或FIX的抗体，其被称作抑制剂。当产生这样的抑制剂时，凝固因子制剂的效应被抑制剂阻断。所以，进行使用大量凝固因子制剂的中和治疗，或使用复杂浓缩物或活化的凝固因子VII制剂(FVIIa制剂)的旁路治疗。血友病A中FVIII活性的测量主要通过基于激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的一步凝固测定(非专利文献3)和产色测定(它是使用纯化的凝固因子重构的系统)(非专利文献4)进行。血友病A中FVIII抑制剂滴度的测量主要通过Bethesda测定或NijmegenBethesda测定(非专利文献5、6)进行。近年来，发现了这样的双特异性抗体：其结合FIX和/或活化的凝固因子IX(FIXa)和凝固因子X(FX)和/或活化的血液凝固因子X(FXa)，并替代FVIII的辅因子功能，或更具体地，促进FIXa的FX活化的功能(非专利文献7、8；专利文献1、2、3)。所述双特异性抗体在功能上替代FVIII以改善由FVIII缺乏或功能异常引起的凝固反应的下降。例如，关于凝血酶产生和APTT(其为凝固反应的指示剂)，所述双特异性抗体会缩短从血友病A患者来源出的血浆的APTT(不论FVIII抑制剂的存在)，并增加凝血酶的产生。所述双特异性抗体的APTT-缩短效应与FVIII相比是显著的。这是因为，血浆中的FVIII仅在被活化的因子X(FXa)或凝血酶活化以后才显示出辅因子活性，而上述双特异性抗体不需要这样的活化过程，且由于该原因，更快速地表现出辅因子功能。此外，得到了针对FIXaFab和针对双特异性抗体的FXFab的抗体，并且确定了来自动物试验的血浆样品中的双特异性抗体的浓度(非专利文献9)。所述双特异性抗体替代FVIII的辅因子功能，因而影响测量FVIII本身的反应性的测定系统。例如，当通过基于APTT的一步凝固测定测量血浆FVIII活性以诊断血友病A的严重程度或监测施用FVIII制剂的患者中的FVIII制剂的药理学活性时，在有所述双特异性抗体存在下促进所述双特异性抗体的凝固时间缩短的作用会强烈地干扰，这会极大地损害测量的准确度。此外，当通过基于APTT的Bethesda测定确定血浆FVIII抑制剂滴度时，在有所述双特异性抗体存在下促进所述双特异性抗体的凝固时间缩短的作用会强烈地干扰，这会极大地损害测量的准确度。也就是说，在施用双特异性抗体的患者中，不可准确地测量FVIII活性和FVIII抑制剂滴度。因此，甚至在有双特异性抗体存在下能够测量FVIII活性和FVIII抑制剂滴度的方法是期望的。引用列表[非专利文献][非专利文献1]NEnglJMed.2007；357(6):535-44[非专利文献2]ThrombRes.2011；127(suppl1):S14-7[非专利文献3]ThrombDiathHaemorrh.1962May15；7:215-28[非专利文献4]Haemostasis.198919:196-204.[非专利文献5]ThrombDiathHaemorrh.1975；34(3):869-72[非专利文献6]ThrombHaemost.1995Feb；73(2):247-51.[非专利文献7]NatMed.2012；18(10):1570-74[非专利文献8]PLoSOne.2013；8(2):e57479.[非专利文献9]JThrombHaemost.2014；12(2):206-13支持性信息[专利文献][专利文献1]WO2005/035756[专利文献2]WO2006/109592[专利文献3]WO2012/067176[专利技术概述][专利技术解决的问题]本专利技术涉及抗体，其用于在有具有在功能上替换FVIII的活性的物质存在下用于测量FVIII的反应性的方法，例如，用于测量FVIII活性或FVIII抑制剂滴度的方法。此外，本专利技术的一个目的是，提供在有具有在功能上替换FVIII的活性的物质存在下用于测量FVIII的反应性(诸如FVIII活性和FVIII抑制剂滴度)的试剂盒等中包含的抗体。[解决问题的手段]为了解决上述问题，本专利技术的专利技术人产生了中和双特异性抗体的活性的物质，并且通过靶向测量FVIII的反应性的试验物品，检索了甚至在有双特异性抗体存在下确保准确度的测量条件。所以，本专利技术的专利技术人发现，通过使用适当浓度(例如，可以充分中和双特异性抗体时的浓度)的针对双特异性抗体的中和抗体，通过基于APTT的一步(one-stage)凝固测定可以准确地评价血友病A患者的血浆中的FVIII活性，并且还发现，通过基于APTT的Bethesda测定可以准确地评价携带FVIII抑制剂的血友病A患者的血浆中的FVIII抑制剂滴度。此外，本专利技术的专利技术人成功地发现了用在所述测量中的试剂盒，其含有针对具有FVIII-替换活性的双特异性抗体的中和抗体。本专利技术是基于这些发现并提供了以下：[1]一种抗体，所述抗体中和具有在功能上替换凝固因子VIII的活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体，所述抗体中和具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.26 JP 2014-1972071.一种抗体，所述抗体中和具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质。2.权利要求1的抗体，其中所述具有在功能上替换凝固因子VIII的活性的物质是结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX以及凝固因子X和/或活化的血液凝固因子X的双特异性抗体。3.权利要求1或2的抗体，其中所述双特异性抗体是下述抗体中的任一种，其中第一多肽与第三多肽结合且第二多肽与第四多肽结合：一种双特异性抗体，其中第一多肽是由SEQIDNO:9的氨基酸序列组成的H链，第二多肽是由SEQIDNO:11的氨基酸序列组成的H链，且第三多肽和第四多肽是SEQIDNO:10的共有L链(Q499-z121/J327-z119/L404-k)；一种双特异性抗体，其中第一多肽是由SEQIDNO:36的氨基酸序列组成的H链，第二多肽是由SEQIDNO:37的氨基酸序列组成的H链，且第三多肽和第四多肽是SEQIDNO:38的共有L链(Q153-G4k/J142-G4h/L180-k)。4.权利要求1至3中任一项的抗体，其中中和抗体是结合Fab的抗体，所述Fab包含结合凝固因子IX和/或活化的凝固因子IX的抗原结合位点，并且所述抗体包含：a)重链可变区，所述重链可变区包含由SEQIDNO:12的氨基酸序列组成的CDR1，由SEQIDNO:13的氨基酸序列组成的CDR2，和...

【专利技术属性】
技术研发人员：井川智之，武藤厚，北泽刚久，铃木司，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP