【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及融合蛋白，其包含具有配体结合结构域的配体结合部分和蛋白酶切割位点，当蛋白酶切割位点被蛋白酶切割活化时，恢复配体的生物活性。本专利技术还涉及生产融合蛋白的方法、它们的用途和包含所述融合蛋白的药物组合物。本专利技术还涉及一种减少配体结合结构域内重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)之间的缔合的方法，这种方法促进一个结构域与另一个结构域的解离。
技术介绍
1、我们的免疫系统的先天能力以其效力、特异性和记忆力而自豪。受这些特征的推动，免疫疗法正在不同领域得到发展，包括传染病、自身免疫、过敏、移植排斥、移植物抗宿主疾病和癌症。细胞因子和趋化因子是小蛋白，其在机体对炎症和免疫攻击的免疫应答中发挥着众所周知的作用，是免疫疗法发展的中心阶段。
2、然而，到目前为止，细胞因子介导的免疫疗法仍然存在一个普遍的问题，即高全身毒性和低至可忽略的疗效。细胞因子在施用时是全身暴露的，因此通过全身作用引起毒性，因此通常只能以非常低的剂量施用细胞因子以避免这种毒性。克服这一问题的一种有吸引力的策略包括将细胞因子与抗体偶联，以局部增加肿瘤部位的细胞因子浓度。通过免疫细胞因子递送至实体癌的细胞因子激活免疫，从而发挥抗肿瘤作用。由于细胞因子(包括il-2、il-12和tnf)具有强毒性，当在局部递送中由抗体递送时，预期这些细胞因子对癌症的局部作用可以增强，同时减轻不良反应(npl1-npl3)。然而，据报道，这种免疫细胞因子在全身扩散，因此，只要存在特异性、高亲和力的细胞因子受体，就可以与血液或组织中的任何细胞结合，从而导致不必要的
3、其他可供选择的方法包括通过蛋白酶可切割的接头使细胞因子与其受体融合。在蛋白酶表达高的环境中，例如癌症环境，接头被切割并且细胞因子从其受体释放。由这种形式组成的免疫细胞因子包括通过可被尿激酶型纤溶酶原激活剂(upa)(npl5)切割的并通过接头连接的tnf-α和tnf受体，以及可被基质金属蛋白酶-2(mmp-2)切割的il-2和il-2受体(npl6)。然而，这些分子中的细胞因子即使在与其受体融合时也具有活性，并且当在蛋白酶切割时被激活时，活性的提高是有限的，即约10倍。
4、最近，已经报道了包含蛋白酶切割后释放的细胞因子的多种融合多肽，包括例如，与基质金属蛋白酶(mmp)可切割的il-2和il-12融合的单链片段可变区(scfv)(npl6，npl7，ptl2，ptl5)和包含蛋白酶可切割区域的其他融合多肽，如在ptl1、ptl3、ptl4、ptl6、ptl7和ptl8中报道的。
5、引用列表
6、专利文献
7、[ptl 1]wo 2009/025846
8、[ptl 2]wo 2011/123683
9、[ptl 3]wo 2018/097307
10、[ptl 4]wo 2019/107380
11、[ptl 5]wo 2019/010219
12、[ptl 6]wo 2019/010224
13、[ptl 7]wo 2020/061526
14、[ptl 8]wo 2021/016640
15、非专利文献
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21、[n本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.多肽，其包含至少一个包含蛋白酶切割位点的抗原结合结构域，当在蛋白酶切割位点处切割时，与蛋白酶切割位点相邻的抗体结构域解离，并且其中通过在所述抗体结构域和相应的相互作用结构域之间的界面处进行的至少一个氨基酸修饰来促进所述解离，其中所述多肽是单价或二价，单特异性或双特异性的抗体，或选自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG-IgG、IgG-Fab或CrossMab抗体组成的组的IgG抗体；或其中所述多肽是抗体片段，所述抗体片段选自由scFv、scFv-Fc、串联scFv、Fab、串联Fab、F(ab')2、Fab2、Fab-scFv-Fc、F(ab')2-scFv2、双特异性Fab2、三特异性Fab2、双特异性双链抗体、三特异性双链抗体、串联双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、双体或三体组成的组。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含抗体可变区，所述抗体可变区包含彼此缔合的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，并且任选地其中所述VH与CH1区缔合，和/或所述VL与CL区缔合，并且其中所述蛋白酶切割位点位于VH和CH1区或VL
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰在VH和VL之间的界面处进行，与未切割状态相比，所述至少一个氨基酸修饰减少了切割状态下VH和VL之间的缔合，并且其中所述氨基酸修饰是VH和VL之间的界面处存在的氨基酸的置换，其中所述用于修饰的氨基酸残基存在于框架区(FR)中。
4.二价同源二聚体融合蛋白，其包含含有抗原结合结构域的全长IgG抗体，其中所述抗原结合结构域包含可变区，其中所述可变区包含彼此缔合的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，并且包含(a)在其可变区的VH和CH1区或VL和CL区之间的边界处的蛋白酶切割位点，和(b)与所述可变区结合的配体，并且其中在蛋白酶切割时，(i)VH或VL从融合蛋白解离，和(ii)配体从可变区解离，并且其中(i)中所述的解离通过在VH和VL之间的界面处进行的至少一个氨基酸修饰来促进，与未切割状态相比，所述至少一个氨基酸修饰在切割状态下减少VH和VL之间的缔合，其中所述修饰是VH和VL之间的界面处存在的氨基酸的置换，并且其中所述用于修饰的氨基酸残基存在于框架区(FR)中。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述至少一个置换选自VH上的位置37、39、44、45、47、91或103和/或VL上的位置38、43、44、46、49、87或98(根据Kabat编号)。
6.二价同源二聚体融合蛋白，其包含两个多肽，每个多肽，从N端到C端由通式(I)表示：
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述配体部分为IL-12，并且其中所述IL-12包含至少一个氨基酸修饰，当暴露于催化IL-12切割的蛋白酶时，所述至少一个氨基酸修饰防止蛋白水解降解，并且其中所述至少一个氨基酸修饰在IL-12和配体结合结构域之间的界面处进行。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中在进行所述至少一个氨基酸修饰后，IL-12不包含KSKREK(SEQ ID NO:1102)的氨基酸序列，而是包含选自由(a)至(p)组成的组的修饰序列：
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述配体结合结构域包含至少一个氨基酸修饰，与未切割状态相比，所述至少一个氨基酸修饰减少了切割状态下VH和VL之间的缔合，并且其中所述修饰是VH和VL之间界面处存在的氨基酸的置换，其中所述氨基酸残基位于框架区(FR)中。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述至少一个置换选自VH上的位置37、45、91或103，和/或VL上的43、46、49或87(根据Kabat编号)。
11.制备根据权利要求1-3中任一项所述的多肽或根据权利要求4-10中任一项所述的二价同二聚体融合蛋白的方法，其包括以下步骤：
12.筛选二价同源二聚体融合蛋白的方法，其中所述融合蛋白包含蛋白酶切割位点和配体结合结构域，其中所述配体结合结构域包含彼此缔合的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，并且其中所述配体结合结构域包含至少一个氨基酸修饰，与在所述切割位点的蛋白酶切割前(“未切割状态”)相比，所述至少一个氨基酸修饰减少在所述切割位点的蛋白酶切割后(“切割状态”)VH和VL之间的缔合，并且其中在所述切割位点的蛋白酶切割后，所述VH或VL从融合蛋白中释放，并且其中所述方法包括以下步骤：
13.筛选二价同源二聚体融合蛋白的方法，其中所述融合蛋白包含蛋白酶切割位点和配体结合结构域，其中所述配体结合结构域包含彼此缔合的重...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.多肽，其包含至少一个包含蛋白酶切割位点的抗原结合结构域，当在蛋白酶切割位点处切割时，与蛋白酶切割位点相邻的抗体结构域解离，并且其中通过在所述抗体结构域和相应的相互作用结构域之间的界面处进行的至少一个氨基酸修饰来促进所述解离，其中所述多肽是单价或二价，单特异性或双特异性的抗体，或选自由igg1、igg2、igg3、igg4、igg-igg、igg-fab或crossmab抗体组成的组的igg抗体；或其中所述多肽是抗体片段，所述抗体片段选自由scfv、scfv-fc、串联scfv、fab、串联fab、f(ab')2、fab2、fab-scfv-fc、f(ab')2-scfv2、双特异性fab2、三特异性fab2、双特异性双链抗体、三特异性双链抗体、串联双链抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、双体或三体组成的组。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述抗原结合结构域包含抗体可变区，所述抗体可变区包含彼此缔合的重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，并且任选地其中所述vh与ch1区缔合，和/或所述vl与cl区缔合，并且其中所述蛋白酶切割位点位于vh和ch1区或vl和cl区或vh和vl之间的边界。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰在vh和vl之间的界面处进行，与未切割状态相比，所述至少一个氨基酸修饰减少了切割状态下vh和vl之间的缔合，并且其中所述氨基酸修饰是vh和vl之间的界面处存在的氨基酸的置换，其中所述用于修饰的氨基酸残基存在于框架区(fr)中。
4.二价同源二聚体融合蛋白，其包含含有抗原结合结构域的全长igg抗体，其中所述抗原结合结构域包含可变区，其中所述可变区包含彼此缔合的重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，并且包含(a)在其可变区的vh和ch1区或vl和cl区之间的边界处的蛋白酶切割位点，和(b)与所述可变区结合的配体，并且其中在蛋白酶切割时，(i)vh或vl从融合蛋白解离，和(ii)配体从可变区解离，并且其中(i)中所述的解离通过在vh和vl之间的界面处进行的至少一个氨基酸修饰来促进，与未切割状态相比，所述至少一个氨基酸修饰在切割状态下减少vh和vl之间的缔合，其中所述修饰是vh和vl之间的界面处存在的氨基酸的置换，并且其中所述用于修饰的氨基酸残基存在于框架区(fr)中。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述至少一个置换选自vh上的位置37、39、44、45、47、91或103和/或vl上的位置38、43、44、46、49、87或98(根据kabat编号)。
6.二价同源二聚体融合蛋白，其包含两个多肽，每个多肽，从n端到c端由通式(i)表示：
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述配体部分为il-12，并且其中所述il-12包含至少一个氨基酸修饰，当暴露于催化il-12切割的蛋白酶时，所述至少一个氨基酸修饰防止蛋白水解降解，并且其中所述至少一个氨基酸修饰在il-12和配体结合结构域之间的界面处进行。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中在进行所述至少一个氨基酸修饰后，il-12不包含kskrek(seq id no:1102)的氨基酸序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：维什努·普里亚卡·雷迪·千千力，南部健，井川智之，山本阳平，佐藤元彦，广庭奈绪香，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：
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