聚氨基酸偶联物制造技术

本公开提供了一种位点特异性蛋白质‑聚氨基酸偶联物及蛋白质‑聚氨基酸环状偶联物。

Poly amino acid conjugate

This discloses a site-specific protein poly amino acid conjugates and protein poly amino acid conjugate ring is provided.

【技术实现步骤摘要】
聚氨基酸偶联物
本公开涉及生物医药领域，具体地涉及位点特异性蛋白质-聚氨基酸偶联物。
技术介绍
蛋白质药物(如抗体、干扰素)已经广泛用于生物医药领域，如靶向治疗、临床诊断等。相比于其他药物，蛋白质药物特异性较好，见效快，毒性低。然而，其稳定性差、血液循环时间短等缺点在一定程度上限制了此类药物的药效和应用。目前，研究较多的提高蛋白质稳定性，延长其血液循环时间的体系是蛋白质-高分子杂化体系。蛋白质药物往往由于体内蛋白酶的降解致使其血液循环时间比较短暂，因此将水溶性较好的高分子材料接枝在蛋白质表面，对蛋白质有一定的保护作用，既可降低蛋白质的免疫原性，也可以降低蛋白酶对蛋白质类药物的降解以延长其血液循环时间。举例而言，干扰素-α2a是治疗慢性丙型肝炎的药物，在其表面接枝一条40kDa的聚乙二醇链将会显著延长其血液循环时间，干扰素-α2a-聚乙二醇杂化材料已应用于临床。然而，目前临床中已应用的蛋白质-高分子杂化体系中主要使用聚乙二醇作为高分子片段。聚乙二醇具有免疫原性低、水溶性好等优点，但随着聚乙二醇在化妆品、食品、制药等领域的广泛应用，大部分人的体内已产生聚乙二醇抗体，反而会加速聚乙二醇修饰的蛋白质类药物在血液中的清除。更严重的是聚乙二醇在人体内不可降解，长期服用则会导致积累毒性。因此，寻找可降解、生物相容性好的高分子材料迫在眉睫。聚氨基酸是一类具有良好生物相容性的高分子材料，其主链的可降解性及侧链的修饰便利性都使得它在蛋白质改性方面具有广泛的应用。更重要的是聚氨基酸具有多肽主链结构、生物相容性好、免疫原性低等特点，非常适合用于蛋白质药物的修饰。由此，本公开了提供了一种蛋白质-聚氨基酸偶联物及一种蛋白质-聚氨基酸环状偶联物以克服本领域尚存在的不足之处。
技术实现思路
在本公开的一方面，提供了蛋白质-聚氨基酸偶联物，其具有如通式1表示的结构：其中：Ptn表示蛋白质；ET当与Ptn的N端连接时，为而当与Ptn的除N端之外的位点连接时，为R1每次出现时独立地表示天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；R2每次出现时独立地表示氢或C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基；n为选自1至300的整数。根据本公开的一实施方案，Ptn是蛋白质类药物，如多肽激素、单克隆抗体、基因工程抗体、干扰素、白介素、集落刺激因子、重组疫苗等。根据本公开的另一实施方案，Ptn是干扰素α2b。根据本公开的一实施方案，R1每次出现时表示天然氨基酸侧链，所述天然氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。根据本公开的另一实施方案，R1每次出现时表示经寡聚乙二醇修饰、磷酸酯修饰、丙烯氧基苄酯修饰、烯丙基二缩三乙二醇修饰的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的侧链。根据本公开的一实施方案，R2每次出现时表示氢或C1-C10烷基。根据本公开的另一实施方案，R2表示氢。本公开的另一方面，提供了蛋白质-聚氨基酸偶联物，其具有如通式2表示的结构：其中：Ptn表示蛋白质；ET当与Ptn的N端连接时，为而当与Ptn的除N端之外的位点连接时，为R1每次出现时独立地表示天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；R2每次出现时独立地表示氢或C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基；n为选自1至200的整数；以及m为选自1至30的整数。根据本公开的又一方面，提供了蛋白质-聚氨基酸环状偶联物，其具有如通式3表示的结构：其中：Ptn表示蛋白质，其具有N端处的半胱氨酸残基和C端处的LPXaT序列，其中Xa表示一种或多种氨基酸；PAA(Gly)m为具有通式4表示的结构：其中：R1每次出现时独立地表示天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；R2每次出现时独立地表示氢或C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基；n为选自10至300的整数；以及m为选自1至30的整数。根据本公开的一实施方案，Ptn是蛋白质类药物，如多肽激素、单克隆抗体、基因工程抗体、干扰素、白介素、集落刺激因子、重组疫苗等。根据本公开的另一实施方案，Ptn是干扰素α2b。根据本公开的一实施方案，R1每次出现时表示天然氨基酸侧链，所述天然氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸。根据本公开的另一实施方案，R1每次出现时表示经寡聚乙二醇修饰、磷酸酯修饰、丙烯氧基苄酯修饰、烯丙基二缩三乙二醇修饰的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的侧链。根据本公开的一实施方案，R2每次出现时表示氢或C1-C10烷基。根据本公开的另一实施方案，R2表示氢。在本公开的另一方面，提供了上述蛋白质-聚氨基酸偶联物或蛋白质-聚氨基酸环状偶联物在制造蛋白质类药物中的用途。附图说明在下文参考附图来进一步描述本文所例示的实施方案，但是所述附图仅仅是为了让本领域技术人员更好地理解本公开内容，而不旨在限定该公开内容的范围。图1为根据本公开一实施方案的位点特异性蛋白质-聚氨基酸偶联物示意图；图2为根据本公开一实施方案的蛋白质-聚氨基酸环化反应示意图；图3为根据实施例1的聚氨基酸P1的MALDI-TOF谱图；图4为根据实施例15的环状偶联物MALDI-TOF谱图，其中O表示L-谷氨酸(乙二醇)3酯链段，G表示甘氨酸链段，角标表示相应链段的聚合度；图5为根据实施例16的ENLYFQ-Cys-eGFP蛋白的UPLC-MS谱图；图6为根据实施例18的Cys-eGFP蛋白的UPLC-MS谱图；图7为根据实施例19的聚氨基酸P1(n＝7)-增强型绿色荧光蛋白偶联物的电泳图，其示出变性胶蛋白质凝胶电泳(A)及非变性胶蛋白质凝胶电泳(B)；图8为根据实施例20的ENLYFQC-增强型绿色荧光蛋白-聚乙二醇-聚甘氨酸偶联物的电泳图，其示出变性胶蛋白质凝胶电泳(A)及非变性胶蛋白质凝胶电泳(B)；图9为根据实施例21的聚氨基酸P1(n＝7)-增强型绿色荧光蛋白-聚甘氨酸-聚乙二醇节点状偶联物的电泳图，其示出变性胶蛋白质凝胶电泳(A)及非变性胶蛋白质凝胶电泳(B)；图10为根据实施例22的增强型绿色荧光蛋白-聚氨基酸P2(n＝7,m＝3)-干扰素α哑铃状偶联物的电泳图，其示出变性胶蛋白质凝胶电泳(A)及非变性胶蛋白质凝胶电泳(B)；图11为根据实施例23的环状(增强型绿色荧光蛋白-聚氨基酸P2(n＝7,m＝3))偶联物的表征：MALDI-TOF(A)，变性胶蛋白质凝胶电泳(B)及免疫印迹分析(C)；图12为根据实施例24的Cys-增强型绿色荧光蛋白(A)、聚氨基酸P2(n＝7,m＝3)-增强型绿色荧光蛋白(B)和环状(增强型绿色荧光蛋白-聚氨基酸P2(n＝7,m＝3))偶联物(C)酶稳定性的表征：图A、B和C内的方框为蛋白质或蛋白质-聚氨基酸偶联物原料；图13为根据实施例26的蛋白-干扰素的UPLC-MS谱图；图14为根据实施例27和28的聚氨基酸偶联物的电泳图；图15为根据实施例29的环状(聚氨基酸P2(n＝7或20,m＝3)-干扰素α-LPETGLEH6)偶联物的表征：A.环状(聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白质‑聚氨基酸偶联物，其具有如通式1表示的结构：

【技术特征摘要】
2015.12.30 CN 201511020841X;2016.07.05 CN 201610521.蛋白质-聚氨基酸偶联物，其具有如通式1表示的结构：其中：Ptn表示蛋白质；ET当与Ptn的N端连接时，为而当与Ptn的除N端之外的位点连接时，为R1每次出现时独立地表示天然氨基酸侧链或非天然氨基酸侧链；R2每次出现时独立地表示氢或C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基；n为选自1至300的整数。2.根据权利要求1所述的蛋白质-聚氨基酸偶联物，其中Ptn是蛋白质类药物，如多肽激素、单克隆抗体、基因工程抗体、干扰素、白介素、集落刺激因子、重组疫苗；优选地，Ptn是干扰素α2b。3.根据权利要求1所述的蛋白质-聚氨基酸偶联物，其中R1每次出现时表示天然氨基酸侧链，所述天然氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸；优选地，R1每次出现时表示经寡聚乙二醇修饰、磷酸酯修饰、丙烯氧基苄酯修饰、烯丙基二缩三乙二醇修饰的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和/或谷氨酸的侧链。4.根据权利要求1所述的蛋白质-聚氨基酸偶联物，其中R2每次出现时表示氢或C1-C10烷基。5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质-聚氨基酸偶联物，其具有如通式2表示的结构：其中：Ptn、ET、R1和R2如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕华，袁劲松，侯颖钦，周雨，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京,11