一种基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌及其构建方法技术

一种基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌及其构建方法，涉及基因工程技术领域，先构建在fur毒力基因的启动子中插入araC PBAD结构的自杀载体，再依次构建减毒猪霍乱沙门氏菌rSC0008和rSC0009突变株，然后将rSC0009突变株中引入Δasd 突变基因，得基于fur基因的含有ΔmanA，ΔrelA::araC PBADlacI TT，ΔPfur::TT araCPBADfur和ΔasdA突变的猪霍乱沙门氏菌减毒载体rSC0012。本发明专利技术作为幼龄动物疫苗载体具有更高的安全性，本发明专利技术可在制备递送猪病原的疫苗载体方面应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，特别是猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌的研究和应用领域。
技术介绍
基因工程方法致弱的鼠伤寒沙门氏菌作为载体表达外源基因，广泛用于肿瘤、病毒病、细菌病、寄生虫病等的治疗研究，已取得了良好效果。但是在许多研究报道中的沙门氏菌载体，要么使减毒载体过度减毒，失去了免疫原性；或者保留了良好的免疫原性，但是载体菌株却减毒不够，缺乏安全性而不能作为疫苗。因此迫切需要研制这样的一种疫苗载体，既要使疫苗载体足够减毒，保证动物完全的安全，又要使疫苗载体和其携带的外源抗原能够诱导出优秀的保护性抗体，抗击相关病原的感染。猪霍乱沙门氏菌是猪的重要病原菌，关于以猪霍乱沙门氏菌为载体递送猪的其他病原抗原的研究，在国内外已有少量报道。而用阿拉伯糖调控猪霍乱沙门氏菌毒力基因的表达和缺失的报道却是鲜少。专利技术人在前期研究过程中发现，用阿拉伯糖调控猪霍乱沙门氏菌的crp毒力基因所产生的载体菌可以诱导出对成年Balb/c小鼠较好的免疫原性，但是疫苗株的减毒不够，作为疫苗株的安全性可能存在一定的风险，如中国专利文献CN104498418A。猪链球菌病是一种重要人畜共患传染病，不仅影响着养猪业健康发展，还严重危害着人类的健康。目前我国的猪用商品化链球菌疫苗还存在着诸多不完善的方面，因此我们选择大多数猪链球菌血清型菌株都有的的Sao（surfaceantigenone)）作为减毒株的异源抗原，对本研究中构建的可调控的延迟减毒的猪霍乱沙门氏菌疫苗候选株的相关特性和免疫效率进行了评价，以其为猪病的防控提供新的思路。重组减毒沙门氏菌疫苗可以诱导机体产生显著的粘膜免疫和细胞免疫，因此具备递送外源抗原的载体特性。已有明确的研究显示沙门氏菌载体对其所携带的外源基因有较多有利作用，例如，可以诱导出针对沙门氏菌本身和外源蛋白的细胞和黏膜免疫应答。研究还发现，有很多减毒沙门氏菌载体因为宿主的免疫压力或者自身有限的定植能力，很难达到野生型菌株那样的免疫原性；而一些减毒沙门氏菌虽然获得足够的免疫应答，但是菌株本身减毒不够，不能作为疫苗载体。此外,沙门氏菌载体作为胞内菌诱导的免疫应答主要是以细胞和黏膜免疫为主，对于大多数病原感染所需要的体液免疫应答显得苍白无力。沙门氏菌crp基因编码腺苷酸环化酶受体蛋白，是细菌在哺乳动物宿主中摄取cAMP的唯一途径；如果使沙门氏菌缺失crp基因，就使其丧失了代谢碳水化合物、氨基酸和小肽能力从而降低其毒力。在前期研究过程中发现（如CN104498418A），用阿拉伯糖调控猪霍乱沙门氏菌的crp毒力基因所产生的载体菌可以诱导出对成年BALB/c小鼠较好的细胞和黏膜免疫原性，但是疫苗株的减毒不够，诱导的体液免疫应答偏弱，作为对仔猪疫苗株的安全性可能依然存在一定的风险，需要继续筛选更加减毒的基因，构建安全的猪霍乱沙门菌疫苗载体。而沙门氏菌诱导的以细胞免疫为主的特性，对于需要体液免疫应答的病原仍然是一个缺陷，迫切需要寻找到平衡细胞免疫和体液免疫的技术和方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种安全性较高、较平衡的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫应答的基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌。本专利技术所述猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌是缺失ΔmanA、ΔPfur::TTaraCPBADfur、ΔrelA::araCPBADlacITT和ΔasdA四种基因的C78-3猪霍乱沙门氏菌，命名为rSC0012。rSC0012(ΔmanA、ΔPfur::TTaraCPBADfur、ΔrelA::araCPBADlacITT和ΔasdA)保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日为2016年6月20日，保藏编号为CGMCCNO.12644，该生物材料的分类命名为：减毒猪霍乱沙门氏菌，拉丁文学名为:Salmonellacholeraesuis。本专利技术优越性体现在：1、减毒株的安全性更高：rSC0012株比拥有ΔPcrp::TTaraCPBADcrp突变的rSC0011减毒株更加减毒，作为幼龄动物疫苗载体具有更高的安全性。2、减毒株诱导出平衡的细胞和体液免疫应答：携带猪链球菌2型的SaoA蛋白的rSC0012(pS-SaoA)可以诱导出更加平衡的细胞、体液和黏膜免疫应答，并可以100%抵抗野生型猪链球菌2型的攻击。结果证明延迟缺失fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体对于幼龄动物的疫苗开发具有实践意义。本专利技术可在制备递送猪病原的疫苗载体方面应用。本专利技术另一目的是提出以上猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌rSC0012的构建方法。本专利技术的技术方案如下：1）构建在fur毒力基因的启动子中插入araCPBAD结构的自杀载体：以减毒猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，分别使用引物P1和P2、P3和P4、以及P5和P6进行PCR扩增后，得到扩增产物片段1、片段2以及片段3，将片段1依次与片段3和片段2连接，产生ΔPfur::TTaraCPBADfur结构序列；再将ΔPfur::TTaraCPBADfur结构序列连接至自杀载体pRE112，获得自杀载体质粒；然后将自杀载体质粒转化至大肠杆菌χ7213中，取得fur毒力基因的启动子中插入araCPBAD结构的自杀载体，命名为χ7213(pS005)；所述的引物P1、P2、P3、P4、P5和P6的核苷酸序列分别如下：P1：5’-ACATGCATGCTGTGACTGGGATGACTTCTTCCCG-3’；P2：5’-TGCGAGCTCGTGTAAATCTTTCGAAGAGCCAA-3’；P3：5’-AAGCTCGAGAGTCATGCGGAATCTGTCCTG-3’；P4：5’-TCCCCCGGGCACTTTTCCGCAATCAAGGCAG-3’；P5：5’-CCTGGTACCTAGGCCTCTAGATAAATAAAAGCAGTTTACAACTCCTAGAATTGT-3’；P6：5’-AGAGGTACCCTCGAGGCTAGCCCAAAAAAACGGG-3’；2）构建减毒猪霍乱沙门氏菌rSC0008：在猪霍乱沙门氏菌C78-3中分别插入突变ΔmanA和ΔrelA::araCPBADlacITT，得减毒猪霍乱沙门氏菌rSC0008；3）构建rSC0009突变株：将减毒猪霍乱沙门氏菌rSC0008引入所述fur毒力基因的启动子中插入araCPBAD结构的自杀载体，得rSC0009突变株；4）构建基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌：将rSC0009突变株中引入Δasd突变基因，得基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌。本专利技术利用阿拉伯糖调控猪霍乱沙门氏菌的铁吸收调节蛋白(ferricuptakeregulator,Fur)延迟缺失，控制猪霍乱沙门氏菌毒力基因缺失的时机，使猪霍乱沙门氏菌对铁的代谢发生紊乱而减毒，同时影响沙门氏菌在淋巴系统的定居能力，导致缺失Fur蛋白的减毒沙门氏菌诱导的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫的水平发生变化，以其获得足够减毒，最终使减毒株能够像野生型猪霍乱沙门氏菌那样高效率入侵宿主淋巴系统，诱导出比较平衡的细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫应答，获得足够安全和平衡的免疫应答的仔猪霍乱沙门氏菌载体菌。本专利技术是在猪霍乱沙门氏菌C78-3上构建的，使本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌，其特征在于所述猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌是缺失ΔmanA、ΔPfur::TT araC PBADfur、ΔrelA::araC PBADlacI TT和ΔasdA四种基因的C78‑3猪霍乱沙门氏菌。

【技术特征摘要】
1.一种基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌，其特征在于所述猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌是缺失ΔmanA、ΔPfur::TTaraCPBADfur、ΔrelA::araCPBADlacITT和ΔasdA四种基因的C78-3猪霍乱沙门氏菌。2.如权利要求1所述基于fur基因的猪霍乱沙门氏菌减毒载体菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1）构建在fur毒力基因的启动子中插入araCPBAD结构的自杀载体：以减毒猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，分别使用引物P1和P2、P3和P4、以及P5和P6进行PCR扩增后，得到扩增产物片段1、片段2以及片段3，将片段1依次与片段3和片段2连接，产生ΔPfur::TTaraCPBADfur结构序列；再将ΔPfur::TTaraCPBADfur结构序列连接至自杀载体pRE112，获得自杀载体质粒；然后将自杀载体质粒转化至大肠杆菌χ7213中，取得fur毒力基因的启动子中插入araCPBAD结构的自杀载体；所述的引物P1、P2、P3、P4、P5和P6的核苷酸序列分别如下：P1：5’-ACATGCATGCTGTGACTGGGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：石火英，李玉安，尚竞，吉贞颖，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32