一种多段DNA并行组装的方法技术

本发明专利技术涉及的是一种多段DNA并行组装的方法。选择利用环形或线形单元载体置入到环形宿主或线形宿主，形成基因载体，再通过回收环形或线形载体，得到重组后的DNA遗传物质。其特点是，能够实现多段DNA的并行同时操作，从而提高DNA组装形成新的DNA结构的效率，并且防止DNA污染和歧化，保证组装后DNA的质量，使之达到设计目的。组装多段DNA所需时间与log(N)近似成正比。组装操作在细胞外或者细胞内进行，使多段DNA分子能够按照任意顺序拼接形成新的DNA结构体。适宜在遗传工程领域基因重组获得新的生物体中应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是遗传工程领域基因重组技术，具体地说是一种多段DNA并行组装的方法。
技术介绍
目前人类所接触到的生命形式，都需要完整的细胞结构才能发挥生物体的全部特征。在细胞当中，DNA是主要的遗传物质，DNA转录形成RNA，RNA翻译得到蛋白质，RNA和蛋白质在生物细胞中实现生物学功能。因此对生物的改造最本质对DNA的改造。对DNA的改造能力决定了人类改造甚至创造生物的能力。2005年以后，合成生物学相关技术需要发展出合适的大规模基因组装技术以适应基因工程、代谢工程的发展和需要。“重组DNA技术” (recombinant DNA technology)专利技术于1973年，至今仍然普遍使用。但是由于对限制性内切酶的依赖，导致该技术具有以下缺陷1、常用限制性内切酶识别序列一般为4-8碱基对，通常为6碱基对，平均每4096bp长度的天然DNA当中就含有一个限制性内切酶位点。长片段的DNA往往含有多种限制性内切酶位点而难于操作。2、限制性内切酶位点需要体外操作，而长片段DNA难于进行体外操作。3、当需要回避限制性内酶切位点时，很难并行化操作。为了克服“重组DNA技术”的缺点解决多段DNA组装问题，近年来有以下方法被提出一、基于内切酶的方法 a) BioBrick 系统MIT的IGEM组织提倡通过人工合成基因来规避天然DNA当中的原本具有的某些限制性内切酶位点，从而利用同尾酶进行并行化组装。BioBrick协议规定一个标准的BioBrick的 DNA当中依次具有如下结构=EcoRI位点、XbaI位点、DNA片段、SpeI位点、PstI位点。其中合成的DNA片段当中不含有EcoRI、XbaI, SpeKPstI位点。XbaI和SpeI是酶切后具有相同粘性末端的同尾酶，但它们在连接之后得到非回文序列，酶切位点消失，从而使组装的产物仍然具有EcoRI位点、XbaI位点、DNA片段、SpeI位点、PstI位点的顺次结构，可用于进一步组装。此方法的缺点1、合成DNA的成本比较高。2、不能避免大片段DNA难于进行体外操作的问题。b)基于产生不特定粘末端的限制性内切酶的多段DNA连接法。少数限制性内切酶的识别序列中含有不特定序列，例如SfiI的识别位点为 GGCCNNNN~NGGCC，其中N可以为ATGC任意碱基对。该酶切割产生三个碱基NNN的任意粘末端。利用不同粘末端的匹配可以同时连接多段DNA。此方法的缺点1、不能回避天然序列中含有该类型酶切位点的问题。2、一次性连接组装的片段数一般不宜超过10段，否则连接效率很低。3、对于大片段难于进行体外操作。二、重组组装技术a)基于枯草芽孢杆菌同源重组的筛选标记交换法。该方法利用到枯草芽孢杆菌当中一种同源重组。每个待组装片段需要预留同源臂，并连接到domino载体当中。Domino载体具有两种不同抗生素的形式。在重组过程中将载体需要在体外先切割成线性并连接成多段重复的线形结构。当基因组当中含有一种抗性的载体时，则下一个组装片段将被置于含有另外一种抗性的载体；该载体携带组装片段与基因组发生重组，替换基因组中原有载体和抗性，从而实现逐次组装片段。组装起来的片段可以再次通过同源重组从枯草芽孢杆菌当中取出，并用于下一次重组。此方法的缺点1、由于完全利用同源重组，当重待组装片段当中有重复序列时会出现错误重组。2、此方法重组效率并不高，很少有人实际采用。b)位点特异性重组组装法美国专利“重组法组装大片段 DNA" (Recombination assembly of large DNA fragments, US7267984)当中描述一个环形基因组和环形质粒的系统。其基因组当中包括3 个位点，分别用于重组插入、切出载体、回收载体。此方法的缺点1、是一个顺序组装系统， 不能并行化。三、体外重组法 a)体外重组方法该方法的原理是体外重组通过不完全PCR或者T4 DNA聚合酶或者λ外切酶分解等方法在获得末端单链伸出的DNA，然后利用碱基配对原理使伸出的单链DNA根据配对结合。 首先通过PCR引物或者基因合成的设计，使待组装的PCR片段末端带有特定的重组片段，一般为30bp ；然后用T4 DNA聚合酶处理这些PCR片段，获得末端具备单链末端伸出的产物， 然后将这些DNA利用体外重组方法组装起来。此方法的缺点1、由于涉及到PCR过程，容易引入突变。2、并不适用于组装长片段。b)改进的体外重组法改进的体外重组方法在原理上和SLIC —致。此方法较SLIC方法有如下改进1、增加了重组片段的长度，通常使用80碱基的同源末端进行重组，少数情况下会使用长达200-250 碱基的同源末端；2、在反应体系当中增加了 DNA聚合酶和连接酶，使单链互补重组后的产物能够补平并连接为双链完整DNA。3、需要时，在反应体系当中可引入了 T5 exo外切酶以切掉单链DNA末端一段非匹配单链DNA。此方法的缺点1、由于重组所需长度的增加，对于天然片段而言，一次PCR难于获得80碱基以上的重组片段，所以该方法主要用于全化学合成基因组。而全化学合成基因组成本过高，导致应用范围有很大限制。2、组装过程中需要用较高拷贝数的载体做中间克隆，在E. coli当中不宜组装超过50Kbp的片段。相关技术Invitrogen的美国专利US5888732保护了如下内容若一个质粒可拆分成为两部分， 其中一部分的两端是两个不互相重组的Attachment重组位点，则此质粒及其重组反应属于US5888732的保护范围。lambda red重组和切出大肠杆菌Lambda Red噬菌体中发现的另外一类重组反应由Lambda Red Alpha, Beta, Exo和大肠杆菌的RecA酶催化。该反应可以催化PCR或者酶切产生的平末端或者粘末端的线性DNA与基因组或者质粒重组。当在大肠杆菌细胞内利用归位内切酶切开染色体时，Lambda Red重组可以诱导切出DNA片段。Lambda Red重组被WO 1999029837等专利保护。线形质粒m5噬菌体及类似的噬菌体能够以线形存在于宿主细菌当中。其两端是封闭的发卡形端粒。基于N15噬菌体的质粒发表很早，按照一般专利法的规定，该线形噬菌体和质粒本身已经不能受专利保护。目前在申请中的美国专利US20090263873，申请保护基于该质粒的克隆载体。本专利技术中的线形单元载体和回收载体利用到了线形质粒。线性基因组大部分原核微生物都具有环形的染色体，少数天然具有线形染色体。 比如根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的染色体中有一条为线形。将附5噬菌体的端粒酶识别位点整合到大肠杆菌染色体的合适位置，并表达端粒酶，可以使大肠杆菌的染色体线形化。此结果已经公开，无专利保护此内容。
技术实现思路
为了克服现有DNA组装技术所存在的缺陷，本专利技术提出了一种多段DNA并行组装的方法。该方法通过利用单元载体置入宿主进行基因对接，然后再回收载体，解决多段DNA 组装的技术问题。本专利技术解决技术方案所采用的方案是对待组装片段进行克隆，得到符合“广义单元载体”结构的单元载体； 根据单元载体的“组装职能”选出一系列含有不同待组装片段的广义单元载体，形成 “可组装队列”；对“可组装队列“进行“队列并行组装”； 具体本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．　一种多段ＤＮＡ并行组装的方法，其特征是：对待组装片段进行克隆，得到符合“广义单元载体”结构的单元载体；根据单元载体的“组装职能”选出一系列含有不同待组装片段的广义单元载体，形成“可组装队列”；对“可组装队列“进行“队列并行组装”；具体步骤：（１）首先，根据组装实施者的需要，将“待组装片段”克隆到“空单元载体”当中形成“单元载体”；取含有待组装片段的“单元载体”和其他“广义单元载体”构成至少一种“初始可组装队列”；然后，对“初始可组装队列”进行“队列并行组装”，直到形成的“可组装队列”中单元载体数量等于１；最后队列中所得的１个载体，包含按照组装实施者需要设计顺序排列的所有待组装片段的组装产物；并且，（２）组装若在细胞内发生，则所需的重组酶由“辅助质粒”表达；组装若在细胞外发生，则所需的重组酶以蛋白形式直接加入；并且，（３）当“队列并行组装”需要时，组装过程中有“辅助质粒”、“组装宿主”、“回收载体”的辅助；所述“广义单元载体”包括“单元载体”和“组装宿主”；所述“单元载体”的结构特征如下：“单元载体”结构具有以下２种可能性：（１）一种是含有单重构位点“单元载体”，按序列顺序依次包括：左臂、左反应端、待组装片段、右反应端、右臂、拓扑重构位点、接左臂；或者，（２）另一种是含有双重构位点单元载体，按序列顺序依次包括：固定臂、回收重构位点、左臂、左反应端、待组装片段、右反应端、右臂、拓扑重构位点、接前述固定臂；所述“待组装片段”连接到“空单元载体”当中形成含有“待组装片段”的“单元载体”；所述“组装宿主”是“待组装片段”长度为０的“单元载体”，具有如下结构特征：固定臂、回收重构位点、左臂、左反应端和右反应端有至少其一、右臂、拓扑重构位点、接前述固定臂；所述“广义单元载体”具有如下特征：（１）　“广义单元载体”的“组装职能”类型的差别在于左反应端、右反应端、拓扑重构位点、回收重构位点的差别；并且，（２）　“广义单元载体”有至少１种类型的“组装职能”；并且，（３）不同种类型“组装职能”的“广义单元载体”的反应端和重构位点的选择要满足：任何一种“组装职能”的“广义单元载体”，并且至少存在一种“组装职能”的“广义单元载体”与其“互相匹配”；并且，（４）　“广义单元载体”的“组装职能”的所有种类要满足：对于任意数量待组装片段，至少存在一种“可组装队列”；所述“回收载体”的结构特征如下：（１）　“回收载体”具有回收重构位点、左反应端、右反应端、拓扑重构位点、接前述固定臂４个重组位点当中至少其中２个；并且，（２）“回收载体”与“匹配”的“广义单元载体”进行“载体置换”的目的产物仍然为“广义单元载体”；所述“待组装片段”，是组装实施者需要组装的片段；“待组装片段”的ＤＮＡ序列，允许是任意不参与反应端、拓扑重构位点、回收重构位点的重组的，并且不参与复制子和筛选标记的筛选的ＤＮＡ序列；所述待组装片段的“左反应端”和“右反应端”是具有发生重组能力的ＤＮＡ序列；并且，在“组装反应”中，同一个单元载体内的左反应端和右反应端不具有互相重组能力；并且，在“组装反应”中，来自不同“组装职能”的“广义单元载体”的左反应端和右反应端重组后消失或者变为在该重组酶下没有重组活性的ＤＮＡ序列；并且，“左反应端”和“右反应端”来自于空单元载体、或者来自于待组装片段；所述“拓扑重构位点”是序列特异性重组位点，或者是端粒酶位点，或者是相互断开的２个端粒，并且在同一“组装反应”中具有发生重组能力，并且在同一“组装反应”中不具有与同一载体内的反应端或回收重构位点重组的能力；并且，当拓扑重构位点是相互断开的２个端粒时，含有拓扑重构位点的载体ＤＮＡ分子在拓扑结构上为线形；所述“回收重构位点”是在“组装反应”中具有发生重组能力的ＤＮＡ序列，并且在同一“组装反应”中不具有与同一载体内的任何反应端重组的能力，并且同一“组装反应”中不具有与同一载体内的拓扑重构位点重组的能力；所述“固定臂”、“左臂”、“右臂”，是任意在“组装反应”中不具有与反应端、拓扑重构位点、回收重构位点重组能力的ＤＮＡ序列，其中包括至少一个复制子和至少一个筛选标记；所述“置换臂”，是任意不参与反应端、拓扑重构位点、回收重构位点的重组的ＤＮＡ序列；所述“回收载体”与“广义单元载体”的“位点匹配”具有如下３点特征：（１）　“回收载体”包含的重组位点中与“广义单元载体”的回收重构位点、左反应端、右反应端、拓扑重构位点重组位点当中至少２个具有发生重组的能力；并且，（２）“回收载体”与“广义单元载体”发生“载体置换”之后的目的产物符合“广义单元载体”的结构特征，并且具有区别于反应前的筛选特征；所述“回收载体”与“广义单元载体”的“载体置换”定义包括如下２个反应的：（１）　“回收载体”与“广义单元载体”回收重构位点、左反应端、右反应端...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：石振宇，
申请(专利权)人：石振宇，
类型：发明
国别省市：21