细胞分离方法技术

本发明专利技术提供了用于从含有红细胞的样品中分离细胞的方法和组合物。该方法用于从含有所需细胞、红细胞和不需要的细胞的样品中回收所需的细胞，包括：a)将样品与组合物相接触，所述组合物包含：i)红细胞凝集试剂，ii)至少一种与磁性颗粒偶联的抗原识别部分，其中具有所述至少一种抗原识别部分的所述颗粒特异性地结合对于一种或多种不需要的细胞成分特异性的至少一种抗原；b)同时应用i)用于红细胞沉降的重力沉降和ii)磁场梯度于所述样品以用于固定所述磁性颗粒，从而产生沉淀和上清液相，和c)从上清液相回收所需的细胞。还公开了用于本发明专利技术方法中的组合物。

Cell separation method

The present invention provides methods and compositions for separating cells from samples containing red blood cells. The method is used for containing the desired from cells, red blood cells and unwanted cells in the samples required for recycling of cells, including: a) and composition of the samples in contact, comprising: I) erythrocyte agglutination reagent, II) and at least one magnetic particle coupling antigen recognition part, wherein with the at least one antigen recognition portion of the particles bind to specific cell components for one or more don't need at least one antigen; b) and application of I) for erythrocyte sedimentation sedimentation and II) on the magnetic field gradient sample for fixing the magnetic particles thus, precipitate and supernatant phase, and C) is required for recycling of cells from the supernatant. Compositions for use in the methods of the invention are also disclosed.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞分离方法专利
本专利技术一般地涉及免疫学领域，特别涉及用于细胞分离的方法和组合物。专利技术背景细胞分离方法被广泛用在进行研究、诊断或临床应用的科学和临床实验室中。细胞分离的大多数策略是基于不同的物理性质，例如大小和密度。通常在处理目标细胞(白细胞)之前必需除去红细胞。这可以通过使用例如，梯度密度离心法、外周血单核细胞(PBMC)样品制备或通过红细胞裂解(其全部是本领域公知的)分离细胞而通过其他方法来实现。在除去红细胞后，利用与识别细胞上的表面抗原的抗原结合部分结合的固相颗粒进行的方法可用于将白细胞分离成亚群。这类方法可以用磁珠(例如，来自MiltenyiBiotecGmbH,Germany的基于柱的MACS技术；US5411863、US5543289、US6020210、US6417011；或非基于柱的：LifeTechnologies,Carlsbad,California)或不用磁珠进行，例如，利用高密度珠(US6730230、US5576185、US6900029、US6004743)进行，其利用致密珠的重力沉降来从生物样品分离所需的或不需要的细胞群体。有几种方法允许直接从全血中正向选择细胞，如使用全血微珠与MACS技术(MiltenyiBiotecGmbH,Germany)。但这些方法仅限于少量的细胞。当非离子聚合物如多糖和合成聚合物在体内输注或在体外添加到红细胞在缓冲液或血浆中的悬浮液中时促进红血细胞(即红细胞)聚集。诱导人红细胞聚集的聚合物的例子是分子量60,000-500,000的葡聚糖、分子量360,000的聚乙烯吡咯烷酮和分子量20,000的聚氧乙烯(POE)。如果将抗凝的血液静置在管中，红细胞在白血细胞之前沉降且白细胞富集的血浆层可以在1个半小时或更长时间后分离。由于红细胞凝集的自发倾向，红细胞沉降比白细胞更迅速。有可能通过添加之前提及的聚合试剂(Skoog和Beck,1956,Blood,11:436)之一来加速红细胞的沉降。密度梯度离心是允许细胞根据它们的大小、形状和密度分离的技术。密度梯度是在离心管中通过不同密度的溶液分层建立的，使得致密端在管的底部。细胞通常在浅的蔗糖或其他惰性碳水化合物梯度上分离，甚至在相对低的离心速度下分离。不连续密度梯度离心通常用于将外周血单核细胞与粒细胞和红细胞分离。例如在所谓的Ficoll密度分离中，全血在FICOLL-上分层，然后离心。红细胞、粒细胞和约50％的单核细胞沉降到细胞沉淀物，而其余50％的单核细胞沉降到Ficoll血浆界面。所有的密度分离技术具有相同的基本限制：它们不能分离具有重叠密度分布的细胞亚群如淋巴细胞亚集，且它们包括费时和费力的离心步骤。具有对细胞表面抗原的亲和力的单克隆抗体被用于在密度梯度离心后进一步分离特定的细胞。抗体特异性技术和密度梯度离心技术可同时使用。一些公开出版物(US5,840,502、US5,648,223、US5,646,004、US5,474,687和US7,316,932)描述了使用不连续密度梯度分离通过选择性地靶向和沉淀(pelleting)所需的/不需要的细胞类型而将致密颗粒用于正向或反向选择。WO00/73794公开了一种利用免疫玫瑰花结(immunorosette)分离细胞的方法。该方法包括将含有有核细胞和红细胞的样品与抗体组合物相接触，这使得有核细胞和红细胞形成免疫玫瑰花结。该抗体组合物包含双功能抗体或四聚体抗体复合物。这里的概念是(1)将样品与抗体组合物在允许有核细胞和红细胞形成免疫玫瑰花结的条件下相接触，其中抗体组合物包含(a)至少一种结合待分离的有核细胞上的抗原的抗体，其连接于(b)至少一种结合红细胞的抗体，和(2)通过离心从样品中除去免疫玫瑰花结。优选地，红细胞特异性的抗体是抗血型糖蛋白A。在出版的StemCellTechnologies手册中描述了使用Ficoll在具有和没有羟乙基淀粉(Hetastarch)的情况下的免疫玫瑰花结方案。这种方法的缺点是，它包括费时和费力的离心步骤。在US7160723中公开了一种方法，它包括将含有血细胞的样品与细胞分离组合物相接触。该组合物是i)葡聚糖，ii)抗血型糖蛋白A抗体，以及iii)一种或多种抗细胞表面抗原的抗体。在某些情况下，抗体是基质结合的以固定这种分子。将含有血细胞样品和分离试剂的混合物轻轻混合30到45分钟。允许凝集的细胞与悬浮液中保留的非凝集细胞分离30至50分钟。该方法的问题是经过1个多小时的耗时过程才能得到所需的细胞以用于进一步的处理步骤。此外不利的是所需细胞的回收率相当低。本专利技术是鉴于上述的现有技术而作出的，并且本专利技术的目的是提供一种用于从生物样品如全血样品、脐带样品和骨髓样品中分离所需细胞和除去不需要的细胞的改进的方法。专利技术概述本专利技术人已经开发一种用于直接从含有红细胞的样品(例如全血)中分离细胞的磁力增强沉降方法和组合物。该方法和组合物与现有技术的方法相比改善了从样品中分离所需细胞和除去不需要的细胞，也就是说，在本专利技术的方法中既不需要首先从样品中除去红细胞，也不需要执行任何费力的样品离心步骤，从而产生对待分离的细胞具有最小应激的非常快速的细胞分离方法。整个过程在一个单一步骤中进行，产生加速的全血细胞分离方法。本文所公开的方法比本领域中已知的方法更快，从而由于细胞上有限的应激而防止细胞的损害。此外，本专利技术的过程与本领域中已知的方法相比得到更高的细胞回收率和纯度。用本专利技术的方法和组合物获得的细胞可以被用于例如高效地制备用于细胞培养、进一步纯化、诊断测试或治疗施用的细胞。通常地，通过本专利技术获得的所需细胞是原始的细胞(untouchedcell)，也就是说，它们处于其自然状态。该细胞与本专利技术组合物的成分(例如与细胞表面抗原结合的抗体)的相互作用不改变，例如刺激，所需的细胞。此外，通过使用本专利技术使得分离所需的时间减少进一步降低了在处理过程中细胞通常遭受的应激。因此，本专利技术提供了对所需细胞的最小心的处理，使它们成为有利于后续应用的最小应激的细胞。出人意料地发现，如果同时(1)红细胞通过试剂(例如，红细胞叠连(rouleaux)形成剂，即红细胞聚集试剂如羟丙基甲基纤维素(HPMC))聚集，和(2)一种或多种细胞成分(即其他的血细胞和/或血小板)被磁性颗粒特异性地结合，其中磁场梯度被施加于所述磁性颗粒，从而固定与磁颗粒结合的细胞而产生细胞团块和上清液相(液体部分)，则样品中细胞的沉降加速。团块包含通过红细胞聚集试剂和已经结合细胞成分的磁性颗粒沉淀的细胞。上清液相基本上不含颗粒而包含还没有提供用于沉淀或固定的细胞。通常，这些是所需的细胞。因此，样品的上清液相可以被移除，并用于进一步的分析和/或在随后的步骤中所需细胞的处理。细胞成分(如红细胞及其他细胞和/或血小板)的同时沉降和固定是对作用在其上的力的反应。这些力可以是由于例如重力沉降，离心加速度和电磁力。各种力可以单独地或与一种或两种其他的力组合发挥作用。优选地，细胞成分(如红细胞及其他细胞和/或血小板)的同时沉降是在1-20×g，更优选地在1-2×g，最优选地在1×g(即没有额外的离心加速度)下进行的。如果包含待处理样品的容器处于静止状态，即没有摆动或离心，则发生1×g的重力沉降本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从含有所需细胞、红细胞和不需要的细胞的样品中富集和/或回收所需细胞的方法，包括：a)将所述样品与组合物接触，其中所述组合物包含：i)红细胞聚集试剂，ii)至少一种与磁性颗粒偶联的抗原识别部分，其中具有所述至少一种抗原识别部分的所述颗粒特异性地结合对于一种或多种的不需要的细胞成分特异性的至少一种抗原；b)对所述样品同时应用i)用于红细胞沉降的重力沉降；和ii)磁场梯度以用于固定所述磁性颗粒，从而产生沉淀和上清液相，并c)从所述上清液相回收所需的细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.25 EP 11190850.51.一种用于从含有所需细胞、红细胞和不需要的细胞的样品中富集和/或回收所需细胞的方法，包括：a)将所述样品与组合物接触，其中所述组合物包含：i)红细胞聚集试剂，ii)至少一种与磁性颗粒偶联的抗原识别部分，其中具有所述至少一种抗原识别部分的所述颗粒特异性地结合对于一种或多种的不需要的细胞成分特异性的至少一种抗原；b)对所述样品同时应用i)用于红细胞沉降的重力沉降；和ii)磁场梯度以用于固定所述磁性颗粒，从而产生沉淀和上清液相，并c)从所述上清液相回收所需的细胞。2.根据权利要求1的方法，其中所述组合物另外包含iii)一种或多种的修饰所述所需细胞的细胞修饰剂。3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·考林，V·胡珀特，
申请(专利权)人：美天旎生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE