产生人抗体的细胞制造技术

本发明专利技术的目的在于提供表达多种人抗体的禽B细胞。本发明专利技术将以下的禽B细胞作为解决手段，所述禽B细胞是在抗体轻链基因座中，插入来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及在抗体重链基因座中，插入来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及在抗体轻链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列取代，和/或在抗体重链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列取代。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及产生人抗体的细胞。更具体而言，涉及产生人抗体的禽B细胞。
技术介绍
抗体在进行生物物质的确定、功能解析等方面是有用的，此外，在疾病的治疗中抗体发挥的作用也大。抗体在生物体内与特定的抗原结合，引起各种生物体内防御反应，例如抗体依赖性细胞伤害(ADCC)活性、补体依赖性细胞伤害(CDC)活性，识别对于生物体而言的“异物”，进行除去。着眼于这样的抗体的能力，抗体医药的开发近年来已经积极地进行。在进行多种多样的疾病的治疗时，需要迅速、简便提供识别各种靶抗原的抗体。目前为止，作为制备具有期望的物理学、生理学特征的抗体组的方法，已使用单克隆抗体的制造技术。制造单克隆抗体时，通常采用使利用生物体内免疫产生的B细胞与骨髓瘤融合的杂交瘤法。但是，该方法除了由于生物体内免疫的利用而产生的免疫耐受之外，还存在取得最终期望的抗体之前花费时间和劳动等大量问题。作为克服免疫耐受的问题的技术，开发了不利用生物体内免疫的方法。该方法是在噬菌体粒子中埋入由各种抗体的可变区构成的单链抗体(singlechainvaluablefragment:scFv)基因，使单链抗体基因产物在噬菌体上展示，从利用该噬菌体所得到的单链抗体文库取得与目的抗原具有亲和性的克隆的方法，被称为噬菌体展示法。该技术在避免免疫耐受方面是优异的，但是由于从噬菌体文库得到的克隆是单链的，因此需要通过重组DNA技术等制备由双链构成的完全型的抗体。此外，在将单链抗体制成完全型抗体的过程中亲和性也会产生变化，需要调整可变区序列的情况也不少。因此，在时间和劳动方面，与利用生物体内免疫的方法相比，很难说特别地有进展。作为克服上述已知的单克隆抗体制造技术的课题的方法，报告了ADLib系统(专利文献1和非专利文献1)和对ADLib系统进一步进行改良的方法(专利文献2)。ADLib系统是，能够简便制备对所有类型的抗原具有期望的结合特性的多种抗体的技术。该方法是从利用自主进行抗体基因的多样化的来源于鸡B细胞的细胞株DT40构建的抗体文库选择性取得期望的抗体的技术。ADLib系统在体外系统抗体制造技术的优点即能够回避免疫耐受的方面，在迅速得到IgM型的完全抗体方面，与现有技术相比是优异的。通常，将抗体作为医药品对动物、人给药时，考虑到将体内的免疫原性最小化，要求与其动物种的类型匹配。因此，利用DNA重组技术制造将由小鼠等制造的单克隆抗体的恒定区取代为人型的嵌合抗体、将抗体的抗原识别部位(complementaritydeterminingregion:CDR)移植入人抗体的人化抗体。但是，在嵌合化·人化的过程中亲和性、功能也产生变化，能够制造保持功能的人化抗体的概率并非很高。此外，由于这些嵌合抗体或人化抗体来源于其他动物种的区域少，虽然与原单克隆抗体相比免疫原性低，但是由于抗原识别部位具有免疫原性，因此也存在出现抗抗体的问题。因此，尝试对小鼠基因导入人抗体基因来制造产生人抗体的动物。专利文献3中，将含有人抗体基因的染色体片段的微细胞移植入小鼠ES细胞，由该ES细胞制造嵌合小鼠，由此制造表达人抗体的嵌合小鼠。此外，非专利文献2中，通过将小鼠抗体基因座的基因组DNA取代为对应的人抗体基因座的基因组DNA，制造表达人抗体的嵌合小鼠。在任意的方法中，虽然均能够取得具有完全来源于人抗体基因的抗原识别部位的抗体，但是由于仍然利用了生物体内免疫，因此，在取得最终期望的抗体之前仍存在需要时间和劳动的问题。以上这类状况中，即使是使用ADLib系统的情形，为了制备抗体医药，需要由禽B细胞产生具有来源于人的氨基酸序列的抗体的方法。此外，为了进行各种疾病的治疗，需要简便产生具有多种抗原识别特性的抗体组的技术。但是，与将人抗体基因导入至小鼠进行“人化”的情形不同，将禽B细胞“人化”时，抗体的多样化系统的不同成为问题。因为在禽、兔子、牛、羊等动物的情形中，在抗体可变区的上游，存在与可变区类似的序列且其自身不作为抗体基因表达的被称为假基因的序列集中的区域，通过被称为基因转变的现象可变区序列的全部或一部分被假基因序列改写，从而产生多种序列。在人、小鼠等动物中，通过V(D)J重组引起抗体的多样化，而在禽、兔子、牛、羊等动物中，通过基因转变这一完全不同的机理引起抗体的多样化。此外，假基因区域有时成为含有非常大量的重复序列的结构，该区域的序列解析非常困难，即使在2015年3月的时间点也不能解码禽抗体重链假基因区域。由于这样的机理的不同、抗体基因座的结构上的问题，因此认为由禽B细胞构建产生期望的人抗体的系统是非常困难的。在这样的背景下，报告了制造将存在于DT40细胞的抗体基因座的可变区和假基因区域取代为来源于人的序列的细胞株(非专利文献3)。该文献中，将禽抗体可变区取代为含有属于荧光蛋白质的绿色荧光蛋白质(GFP)和青色荧光蛋白质(CFP)以及属于重组酶识别部位的attP序列的基因序列后，利用重组酶制造插入人抗体可变区和后述的假基因序列的DT40细胞，确认发生基因转变(非专利文献3、4)。但是，由于恒定区直接利用来源于禽的序列，因此表达的抗体分子是人-禽的嵌合抗体，抗体的免疫原性非常高。此外，由于轻链成为来源于人的κ链与来源于禽的λ链的融合蛋白，因此该抗体分子与天然的人抗体大大不同。因此，在制造人的治疗用抗体中需要进一步的嵌合化的操作，在嵌合化·人化的过程中仍然存在亲和性、功能产生变化的可能性。此外，此处使用的假基因区域的序列，关于轻链，利用了将插入的人抗体可变区的各个CDR序列每个CDR为1个氨基酸地取代为Tyr或Trp的人工序列的集合体即minimalistlibrary、对天然存在的人抗体可变区的变体在框架区实施变异的序列，关于重链，由将插入的人抗体可变区的各个CDR序列每个CDR为1个氨基酸地取代为Tyr或Trp的人工序列和其变异序列构成。这些序列是以利用少的假基因应对多种抗原作为目的而设计的序列，但是关于该细胞中的抗原特异性的抗体的取得没有报告。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特许第4214234号专利文献2:WO2008/047480专利文献3:WO97/07671非专利文献非专利文献1:Seoetal,NatureBiotech,Volume23,pp731-735,2005非专利文献2:RecombinantAntibodiesforImmunotherapy,pp100-108,2009,CambridgePress非专利文献3:Schusseretal,PLOSONE,Volume8issue11e80108,2013非专利文献4:Leightonetal,FrontiersinImmunology,Volume6Article126,2015
技术实现思路
鉴于上述事实，本专利技术的目的在于提供产生多种人抗体的禽B细胞。此外，本专利技术的目的在于提供从该禽B细胞产生抗体的方法。专利技术人等对产生多种人抗体的细胞的制造进行深入研究，最终在禽B细胞的抗体轻链和重链基因座中，插入或取代人抗体的轻链和重链的可变区和恒定区的基因后，成功取得表达人抗体的转化细胞。此外，专利技术人等进一步制造了在轻链·重链中插入多个来源于人的抗体可变区序列作为假基因的转化细胞，并将该细胞进行HDAC抑制剂处理后，确认与原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种禽B细胞，其特征在于，在抗体轻链基因座中，插入来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及，在抗体重链基因座中，插入来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及，在抗体轻链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列取代，和/或，在抗体重链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列取代。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.02 JP 2014-0952361.一种禽B细胞，其特征在于，在抗体轻链基因座中，插入来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及，在抗体重链基因座中，插入来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分，或用来源于人抗体重链可变区和人抗体重链恒定区的DNA序列的全部或一部分取代，以及，在抗体轻链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体轻链可变区的DNA序列取代，和/或，在抗体重链假基因座中，插入2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列，或用2个以上来源于人抗体重链可变区的DNA序列取代。2.根据权利要求1所述的禽B细胞，其特征在于，在抗体轻链假基因座中插入的或取代该抗体轻链假基因座的序列的、来源于人抗体轻链可变区的DNA序列的数量是5个以上。3.根据权利要求1所述的禽B细胞，其特征在于，在抗体重链假基因座中插入的或取代该抗体重链假基因座的序列的、来源于人抗体重链可变区的DNA序列的数量是5个以上。4.根据权利要求1所述的禽B细胞，其特征在于，在抗体轻链假基因座中插入的或取代该抗体轻链假基因座的序列的、来源于人抗体轻链可变区的DNA序列的数量是15个以上。5.根据权利要求1所述的禽B细胞，其特征在于，在抗体重链假基因座中插入的或者取代该抗体重链假基因座的序列的、来源于人抗体重链可变区的DNA序列的数量是15个以上。6.根据权利要求1～5中任一项所述的禽B细胞，其特征在于，在抗体轻链基因座中插入的来源于人抗体轻链可变区的DNA序列的位置位于来源于人抗体轻链恒定区的DNA序列所存在的位置的上游，以及在抗体重链基因座中插入的来源于人抗体重链可变区的...

【专利技术属性】
技术研发人员：桥本修一，内木智朗，川田滋久，浅越健二郎，矢吹崇吏，佐野瞳，宫井俊辅，高桥直树，武居亚希，泽田笃志，
申请(专利权)人：凯奥目生物科学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP