抗CDCP1抗体制造技术

本发明专利技术的目的在于，提供可以用作副作用少的抗癌剂等的有效成分的抗hCDCP1抗体和ADC化的该抗hCDCP1抗体。具体而言，本发明专利技术为抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体与人CDCP1(CUB domain

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗CDCP1抗体


[0001]本专利技术涉及抗CDCP1抗体。更具体而言，涉及与健康人骨髄造血干细胞的结合性低的抗人CDCP1抗体及其片段、以及它们的用途。

技术介绍

[0002]人CDCP1(cub domain containing protein 1，含CUB结构域蛋白1)(以下也称为hCDCP1)是由总长度836个氨基酸组成的、具有3个CUB结构域(complement C1r/C1s、Uegf、Bmp1结构域)的I型跨膜蛋白(参照非专利文献1)。CUB结构域除存在于BMP1、C1r之外，还存在于TMPRSS7等具有蛋白酶活性的蛋白质、LRP3、NRP1和TLL2等与细胞间相互作用相关的蛋白质等多种蛋白质中，但缺乏对分子功能的统一认识。在胞外域的N端侧具有大量的N
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糖基化位点，已观察到糖基化程度与癌细胞的转移性状态之间具有相关性(参照非专利文献2)。hCDCP1在各种细胞中表达，但其可溶性配体不明，另一方面，暗示与EGFR等各种膜蛋白相互作用(参照非专利文献3)。hCDCP1蛋白在电泳中显示出135kDa的条带尺寸，但CUB1结构域与CUB2结构域之间的第368/369位或第369/370位的氨基酸位点被丝氨酸蛋白酶切割时，会产生70kDa的片段。(参照非专利文献1)。
[0003]通过Src家族激酶的作用等，hCDCP1的位于胞内区域的第734位、第743位、第762位的酪氨酸残基可被磷酸化。被磷酸化的hCDCP1通过将PKCδ磷酸化等诱发下游的信号，促进支架非依赖性增殖、细胞外基质的降解、细胞迁移和上皮间质转化等，引发癌细胞的转移。另外，已知hCDCP1与EGFR、HER2等各种分子相互作用而促进癌细胞的增殖、转移。
[0004]据报道，hCDCP1在各种癌细胞和正常组织中表达。例如，报道了hCDCP1mRNA和蛋白在前列腺癌、肺癌、大肠癌、卵巢癌等癌细胞、由这些建立的细胞系以及结肠、皮肤、小肠和前列腺等正常组织中表达(参照专利文献1、专利文献2)。
[0005]迄今为止，已知一些针对hCDCP1的抗体(以下有时也称为抗人CDCP1或抗hCDCP1抗体)。
[0006]专利文献2中公开了：抗hCDCP1多克隆抗体以及使用了该抗体的卵巢癌的筛选方法、诊断方法和治疗方法。专利文献1中公开了抗hCDCP1单克隆抗体(克隆名：25A11)。公开了：25A11上结合有皂草素的ADC(antibody
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drug
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conjugate)化抗体在体外对PC3癌细胞株显示出细胞毒性活性，通过将该ADC化抗体静脉内给药而发挥显著的肿瘤生长抑制活性。
[0007]另外，专利文献4中公开了多个抗hCDCP1抗体，且公开了：通过吡咯并苯并二氮杂卓(PBD：pyrrolobenzodiazepine)而ADC化的抗hCDCP1抗体在体外对前列腺癌细胞株显示出细胞毒性活性；通过MMAE(monomethyl auristatin E，一甲基澳瑞他汀E)而ADC化的抗hCDCP1抗体在移植了乳腺癌细胞株、大肠癌细胞株或前列腺癌细胞株的小鼠移植瘤模型中显示出抗肿瘤活性。
[0008]进而，专利文献3中公开了：4个抗hCDCP1单克隆抗体(CUB1抗体、CUB2抗体、CUB3抗体和CUB4抗体；分别来自杂交瘤克隆CUB1～4)。公开了：这些抗hCDCP1单克隆抗体与在正常CD34阳性(CD34
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)细胞和正常CD133阳性(CD133
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)细胞中表达的hCDCP1蛋白结合，因此该抗
体可以用于造血干细胞、间充质干细胞和神经干细胞等的分离和鉴定。
[0009]现有技术文献
[0010]专利文献
[0011]专利文献1：国际公报WO2008/133851号
[0012]专利文献2：欧州专利公开公报1677875号
[0013]专利文献3：美国专利公开公报7,541,030号
[0014]专利文献4：国际公报WO2018/112334号
[0015]非专利文献
[0016]非专利文献1：Mostageer等,Oncogene 20:4402
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4408 2001.
[0017]非专利文献2：Yang等,Oncotarget 6:43743
‑
58 2015.
[0018]非专利文献3：He等,Oncoscience 3:5
‑
8 2016.

技术实现思路

[0019]专利技术要解决的问题
[0020]如上所述，已经证实了hCDCP1 mRNA和hCDCP1蛋白在正常组织/细胞和癌组织/细胞中表达，示出了专利文献3中公开的CUB1抗体除了与表达hCDCP1的K562细胞(人慢性髓系白血病细胞)结合之外还与正常的CD34
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/CD38
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骨髄细胞强烈结合。
[0021]进而，本专利技术人等证实了：专利文献2中公开的25A11来源的抗hCDCP1抗体、专利文献3中公开的CUB4抗体和由BioLegend公司市售的抗hCDCP1抗体(克隆名：CUB1)除了与表达hCDCP1的各种癌细胞结合之外，还与正常的CD34阳性骨髄细胞强烈结合(参照图11、图12、图13的A、图15和图16)。
[0022]骨髄细胞中的CD34阳性细胞群中包含具有使所有人类血液系统细胞再生的能力的造血干细胞，CD34被认为是人造血干细胞的细胞表面标记物之一。
[0023]在使用这些抗hCDCP1抗体作为抗肿瘤药时，这些已知抗体与造血干细胞强烈结合的性质会引发严重的问题。即，抗hCDCP1抗体所结合的正常的骨髄细胞受到免疫功能(例如ADCC活性)的攻击，使细胞所属组织发生功能障碍和功能抑制，极有可能产生严重的副作用。进而，将抗hCDCP1抗体ADC化的情况下，ADC化抗体也会对正常组织和细胞造成伤害，从而导致更显著且严重的不良影响。
[0024]因此，本专利技术的目的在于，提供诱发上述严重的副作用的可能性低的抗hCDCP1抗体。
[0025]用于解决问题的方案
[0026]本专利技术人等对各种抗hCDCP1抗体的抗原结合特性进行了研究，结果成功地制备了具有如下性质的新型抗hCDCP1抗体，所述性质是与表达hCDCP1的各种癌细胞结合、而与表达hCDCP1的造血干细胞等CD34阳性细胞相对较弱地结合。
[0027]因此，本专利技术为抗体及其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体与CDCP1结合且与CD34阳性细胞的结合性低。
[0028]专利技术的效果
[0029]根据本专利技术，提供与CD34阳性细胞(例如，CD34阳性骨髄细胞)的结合性低的抗hCDCP1抗体。本专利技术的抗hCDCP1抗体通过ADC化而显示出抗肿瘤活性，因此作为副作用少的
抗癌剂发挥效果。
附图说明
[0030]图1示出：hCDCP1胞外域纯化蛋白的凝胶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体与人CDCP1(含CUB结构域蛋白1)结合且与人CD34阳性细胞的结合性低。2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述与人CD34阳性细胞的结合性的评价中的比较抗体浓度为10ng/ml以上的任意浓度。3.一种抗体或其抗原结合片段，其特征在于，CDR(互补决定区)1～3的氨基酸序列满足下述(A)～(K)中的任意者，(A)具有：包含序列号25所示的氨基酸序列的重链CDR1、包含序列号26所示的氨基酸序列的重链CDR2、包含序列号27所示的氨基酸序列的重链CDR3、包含序列号29所示的氨基酸序列的轻链CDR1、包含序列号30所示的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含序列号31所示的氨基酸序列的轻链CDR3；(B)具有：包含序列号33所示的氨基酸序列的重链CDR1、包含序列号34所示的氨基酸序列的重链CDR2、包含序列号35所示的氨基酸序列的重链CDR3、包含序列号37所示的氨基酸序列的轻链CDR1、包含序列号38所示的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含序列号39所示的氨基酸序列的轻链CDR3；(C)具有：包含序列号41所示的氨基酸序列的重链CDR1、包含序列号42所示的氨基酸序列的重链CDR2、包含序列号43所示的氨基酸序列的重链CDR3、包含序列号45所示的氨基酸序列的轻链CDR1、包含序列号46所示的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含序列号47所示的氨基酸序列的轻链CDR3；(D)具有：包含序列号49所示的氨基酸序列的重链CDR1、包含序列号50所示的氨基酸序列的重链CDR2、包含序列号51所示的氨基酸序列的重链CDR3、包含序列号53所示的氨基酸序列的轻链CDR1、包含序列号54所示的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含序列号55所示的氨基酸序列的轻链CDR3；(E)具有：包含序列号57所示的氨基酸序列的重链CDR1、包含序列号58所示的氨基酸序列的重链CDR2、包含序列号59所示的氨基酸序列的重链CDR3、包含序列号61所示的氨基酸序列的轻链CDR1、包含序列号62所示的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含序列号63所示的氨基酸序列的轻链CDR3；(F)具有：包含序列号65所示的氨基酸序列的重链CDR1、包含序列号66所示的氨基酸序列的重链CDR2、包含序列号67所示的氨基酸序列的重链CDR3、
包含序列号69所示的氨基酸序列的轻链CDR1、包含序列号70所示的氨基酸序列的轻链CDR2、包含序列号71所示的氨基酸序列的轻链CDR3；(G)具有：包含序列号73所示的氨基酸序列的重链CDR1、包含序列号74所示的氨基酸序列的重链CDR2、包含序列号75所示的氨基酸序列的重链CDR3、包含序列号77所示的氨基酸序列的轻链CDR1、包含序列号78所示的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含序列号79所示的氨基酸序列的轻链CDR3；(H)具有：包含序列号81所示的氨基酸序列的重链CDR1、包含序列号82所示的氨基酸序列的重链CDR2、包含序列号83所示的氨基酸序列的重链CDR3、包含序列号85所示的氨基酸序列的轻链CDR1、包含序列号86所示的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含序列号87所示的氨基酸序列的轻链CDR3；(I)具有：包含序列号89所示的氨基酸序列的重链CDR1、包含序列号90所示的氨基酸序列的重链CDR2、包含序列号91所示的氨基酸序列的重链CDR3、包含序列号93所示的氨基酸序列的轻链CDR1、包含序列号94所示的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含序列号95所示的氨基酸序列的轻链CDR3；(J)具有：包含序列号97所示的氨基酸序列的重链CDR1、包含序列号98所示的氨基酸序列的重链CDR2、包含序列号99所示的氨基酸序列的重链CDR3、包含序列号101所示的氨基酸序列的轻链CDR1、包含序列号102所示的氨基酸序列的轻链CDR2、包含序列号103所示的氨基酸序列的轻链CDR3；(K)具有：包含序列号105所示的氨基酸序列的重链CDR1、包含序列号106所示的氨基酸序列的重链CDR2、包含序列号107所示的氨基酸序列的重链CDR3、包含序列号109所示的氨基酸序列的轻链CDR1、包含序列号110所示的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含序列号111所示的氨基酸序列的轻链CDR3。4.一种抗体或其抗原结合片段，其特征在于，CDR(互补决定区)1～3的氨基酸序列满足下述(L)或(M)中的任意者，(L)具有：包含序列号49所示的氨基酸序列的重链CDR1、包含序列号50所示的氨基酸序列的重链CDR2、包含序列号51所示的氨基酸序列的重链CDR3、包含序列号53所示的氨基酸序列的轻链CDR1、
包含序列号54所示的氨基酸序列的轻链CDR2、和包含序列号55所示的氨基酸序列的轻链CDR3；(M)满足所述(L)的抗体中，具有Kabat定义中的重链第10...

【专利技术属性】
技术研发人员：桥本修一，中村康司，佐野瞳，吉冈亚希子，武居亚希，
申请(专利权)人：凯奥目生物科学株式会社，
类型：发明
国别省市：