一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法和应用技术

本发明专利技术涉及细胞筛选技术领域。本发明专利技术公开了一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，该方法包括以下步骤：(1)制备Oleyl

【技术实现步骤摘要】
一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞筛选
，尤其涉及一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法。

技术介绍

[0002]单克隆抗体(后简称单抗)是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单抗具有纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少等特点，目前是多种人类疾病诊断及治疗的重要工具。
[0003]特异性全人单抗基因的获取方法主要有杂交瘤+抗体人源化技术、噬菌体展示技术、单个B细胞技术和转基因小鼠技术等。其中，通过单个B细胞技术获取特异性单抗基因具有高通量、亲和力高、特异性强等优点，故在抗病毒治疗、神经性疾病治疗、免疫疾病治疗等方面显出了独特的优势和良好的应用前景。单个B细胞技术的原理是根据每一个B细胞只含有一个功能性重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序列，以及每一个B细胞只产生一种特异性抗体的特性，从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性B细胞，通过单细胞测序技术获得单个B细胞中特异性单抗可变区重链和轻链基因序列，然后在相应的表达系统表达即可获得具有生物活性的单抗。
[0004]尽管相对于杂交瘤+抗体人源化技术、噬菌体展示技术，利用单个B细胞技术获得特异性全人单抗基因具有许多突出优点，但是现有的单个B细胞技术获取特异性单抗基因仍然存在以下问题：(1)基于BCR染色单个B细胞技术，是利用荧光标记的抗原对B细胞的BCR进行染色的方法，BCR即B细胞抗原受体，是一种位于B细胞表面的负责特异性识别及结合抗原的细胞表面分子，只能通过检测BCR的特异性来获得BCR基因的可变区基因序列，虽然BCR基因的可变区与其分泌的抗体的可变区序列一样，但是该方法不能获得全抗体基因序列；(2)成熟的浆细胞表面没有BCR，所以该方法难以获得亲和力更高的浆细胞中的特异性抗体基因。单个浆细胞技术相对于基于BCR染色单个B细胞技术，其可以克隆到抗体的全基因序列，且亲和力更高。但目前现有的单个浆细胞技术仍然还有较大的改进空间：(1)单个浆细胞培养困难，单个细胞分泌的抗体量极低，需要约一周的培养时间才能检测到；(2)该方法不但需要使用分选式流式细胞仪，还需要使用单细胞培养和检测的大型贵重设备，成本更加昂贵。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提出一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，以Oleyl
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PEG4000
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NHS
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二抗的一端与浆细胞连接，另一端结合该浆细胞分泌的抗体，当分泌的抗原特异性的抗体与荧光物质标记的抗原结合后，当荧光物质被相应的激发光激发时，浆细胞能发出特定颜色的光，发光强度越大，表示浆细胞分泌抗体的能力越强，从而可分辨强阳性的浆细胞，可从强阳性的浆细胞得到特异性全人单克隆抗体基因。本专利技术的方法获取强阳性的浆细胞的方法简单快捷，用到的设备成本低，且能获得特异性全人单克隆抗体
基因。
[0006]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，该方法包括以下步骤：
[0008](1)将Oleyl
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PEG4000
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NHS与二抗偶联，得到Oleyl
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PEG4000
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NHS
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二抗；
[0009](2)在外周血单个核细胞或CD138
+
细胞中加入Fc受体封闭剂，封闭细胞膜表面的Fc受体；
[0010](3)接着加入Oleyl
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PEG4000
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NHS
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二抗，之后进行细胞培养，培养过程中外周血单个核细胞或CD138
+
细胞分泌抗原特异性的抗体lgG，之后，洗去未被Oleyl
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PEG4000
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NHS
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二抗捕获的lgG，得到细胞膜上连接有Oleyl
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PEG4000
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NHS
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二抗
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lgG的外周血单个核细胞或CD138
+
细胞，即得到处理后的细胞；
[0011](4)以荧光物质标记抗原；
[0012](5)将荧光物质标记的抗原加入处理后的细胞悬液中，进行培养，处理后的细胞的细胞膜表面形成Oleyl
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PEG4000
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NHS
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二抗
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lgG
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荧光物质标记的抗原；
[0013](6)经分选式流式细胞仪富集抗原特异性的外周血单个核细胞或CD138
+
细胞后，使用单细胞显微挑取仪挑取强阳性浆细胞；
[0014](7)对强阳性浆细胞进行DNA提取，得到特异性全人单克隆抗体基因。
[0015]进一步的，所述抗原为新冠病毒刺突S蛋白。
[0016]进一步的，所述二抗为羊抗人lgGFc、兔抗人IgGFc或SPA蛋白。
[0017]进一步的，所述步骤(1)中，偶联方法为：将Oleyl
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PEG4000
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NHS溶液在4℃下搅拌，边搅拌边加入二抗，持续搅拌8h，进行超滤和过滤除菌，得到Oleyl
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PEG4000
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NHS
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二抗。
[0018]进一步的，所述步骤(2)中，Fc受体封闭剂为CD16/32抗体、羊抗人lgG，封闭条件为：4℃和30min。
[0019]进一步的，所述步骤(4)中，荧光物质为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白和AlexaFluor488中的一种。
[0020]进一步的，所述步骤(3)中，细胞培养的培养条件为：37℃、5％CO2和30min。
[0021]进一步的，所述步骤(5)中，细胞培养的培养条件为：37℃、5％CO2和30min。
[0022]进一步的，所述步骤(5)中，采用1640不完全培养基进行培养。
[0023]上述高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法所得的特异性全人单克隆抗体基因的用途：应用于制备抗体。
[0024]本专利技术提供的技术方案可以包括以下有益效果：
[0025]本专利技术通过一种两亲性物质Oleyl
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PEG4000
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NHS能够快速简便染色分泌抗原特异性抗体的浆细胞，经分选式流式细胞仪分选富集抗原特异性的浆细胞后，使用单细胞显微挑取仪挑取强阳性浆细胞，利用单细胞测序技术即可获得亲和力更高的浆细胞中的特异性抗体基因，缩短了高亲和力特异性抗体基因的筛选时间，不依赖单细胞培养和检测的大型贵重设备，减少了人力和成本。
附图说明
[0026]图1是本专利技术一个实施例的荧光下经单细胞显微挑取仪挑取后毛细管中的抗原特异性的浆细胞效果图；
[0027]图2是本专利技术一个实施例的可见光下经单细胞显微挑取仪挑取后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效获得特异性全人单克隆抗体基因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)将Oleyl
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NHS与二抗偶联，得到Oleyl
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二抗；(2)在外周血单个核细胞或CD138
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细胞中加入Fc受体封闭剂，封闭细胞膜表面的Fc受体；(3)接着加入Oleyl
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NHS
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二抗，之后进行细胞培养，培养过程中外周血单个核细胞或CD138
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细胞分泌抗体lgG，之后，洗去未被Oleyl
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二抗捕获的lgG，得到细胞膜上连接有Oleyl
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PEG4000
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NHS
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二抗
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lgG的外周血单个核细胞或CD138
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细胞，即得到处理后的细胞；(4)以荧光物质标记抗原；(5)将荧光物质标记的抗原加入到处理后的细胞悬液中，进行培养，处理后的细胞的细胞膜表面形成Oleyl
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PEG4000
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二抗
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lgG
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荧光物质标记的抗原；(6)经分选式流式细胞仪富集抗原特异性的外周血单个核细胞或CD138
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细胞后，使用单细胞显微挑取仪挑取强阳性细胞；(7)对强阳性浆细胞进行DNA提...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐勇，梁家杰，高智星，
申请(专利权)人：广东忠信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：