一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术及应用，涉及免疫学筛选技术领域。本发明专利技术高效筛选技术如下：将Oleyl

【技术实现步骤摘要】
一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术及应用


[0001]本专利技术涉及免疫学筛选
，尤其涉及一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术及应用。

技术介绍

[0002]单克隆抗体是由单一克隆B淋巴细胞杂交瘤产生的、识别抗原分子某一特定抗原决定簇，具有高度特异性的抗体。单克隆抗体具有纯度高、特异性强、效价高、交叉反应少等特性，目前已广泛应用于检验医学的诊断试剂、蛋白质提纯和肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术等方面，目前单克隆抗体已经成为解决生物学、医学等诸多领域上的重要手段。
[0003]1975年，德国学者Kohler和Milstein专利技术了杂交瘤技术，成功将骨髓瘤细胞和产生特异性抗体的B淋巴细胞融合成杂交瘤细胞，这种合成的杂交瘤细胞可产生针对某一种特定抗原决定簇的单克隆抗体。1986年鼠源单克隆抗体药物Muromonab的上市拉开了单克隆抗体发展的序幕，随后的50年里，单克隆抗体药物经历了鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体四个阶段，产生了抗体偶联药物、抗体融合蛋白、单域抗体等多种新型抗体药物，标志着免疫疗法黄金时代的开启。单克隆抗体的推陈出新归根于单克隆抗体技术的不断发展与创新。目前广泛应用的单克隆抗体制备技术有：杂交瘤技术、噬菌体展示技术、天然全人源库技术和单个B细胞技术，其中单个B细胞技术，是近年来新发展的一类快速制备单克隆抗体的技术。
[0004]单个B细胞技术也叫单个B细胞抗体制备技术，是根据每一个B细胞只含有一个功能性重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序列，以及每一个B细胞只产生一种特异性抗体的特性，从免疫动物组织或外周血中分离单核细胞，然后通过荧光抗原结合B细胞膜上的特异性BCR将抗原特异性B细胞染色，通过流式分选和单细胞测序获得抗体基因序列，然后在真核细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。这种方法保留了重链和轻链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效率高、全天然源性的特点，也成为了目前快速开发单克隆抗体的重要策略。
[0005]随着单个B细胞技术的发展，新型单个B细胞的高效精准筛选技术为制备特异性较高的抗体提供更好的平台，采用单个B细胞技术制备单克隆抗体中，需要筛选和分离单个B细胞，B细胞通常来源于免疫动物组织或者外周血中分离的浆细胞和记忆B细胞，目前对于细胞的筛选常用的方法将细胞染色后再进行筛选，现有细胞染色技术通常是采用细胞表面荧光检测法1(参照Li,X.；Bian,H.；Yu,S.A Rapid Method forAntigen
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Specific Hybridoma Clone Isolation.Analytical Chemistry 2018,90(3),2224
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2229.)，通过一种两亲性物质将抗原偶联在抗体分泌的细胞的表面，抗体分泌细胞分泌的抗体会被偶联在其表面的抗原捕获，再加入荧光标记的抗人IgG Fc二抗结合被抗原捕获的抗体，可将抗体分泌细胞染色。采用上述通过细胞表面荧光检测法筛选分泌特异性抗体的浆细胞时，会受到多方面的限制，首先这种细胞染色方法对二抗的种属性存在限制，需要根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗，并且二抗需要与一抗的类别和亚型相匹配。其次这种染
色方法对于不能分泌抗体的记忆B细胞无法进行有效染色，以至于无法通过细胞表面荧光检测法同时分离筛选浆细胞和记忆B细胞，导致筛选效率较低。

技术实现思路

[0006]针对
技术介绍
提出的问题，本专利技术的目的在于提出一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术，能够同时对B淋巴细胞和浆细胞进行染色，从而能同时筛选记忆B细胞和浆细胞，同时，本专利技术高效筛选技术不受种属限制，可以筛选人类和多种哺乳动物的记忆B淋巴细胞和浆细胞，解决了现有荧光检测法在筛选浆细胞时存在种属性限制的问题，同时解决了现有荧光检测法能以对记忆B细胞进行染色和筛选的问题。
[0007]本专利技术的另一目的在于提出一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术的应用，能够筛选得到记忆B细胞和浆细胞。
[0008]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术，包括以下步骤：
[0010](1)将Oleyl
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PEG4000
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NHS与金黄色葡萄球菌A蛋白偶联，得到Oleyl
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PEG4000
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NHS
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SPA；
[0011](2)用荧光物质标记特异性抗原，得到荧光物质
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特异性抗原；
[0012](3)将Oleyl
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PEG4000
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NHS
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SPA加入待筛选细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞；
[0013](4)将荧光物质
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特异性抗原加入到步骤(3)中处理后的待筛选细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞；
[0014](5)在步骤(4)中处理后的待筛选细胞中加入不完全培养基，分选待筛选细胞，得到记忆B细胞和浆细胞。
[0015]进一步的，在所述步骤(3)中，所述Oleyl
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PEG4000
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NHS
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SPA的浓度为0.05～0.15mg/mL；
[0016]按照48孔细胞培养板计算，所述Oleyl
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PEG4000
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NHS
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SPA的添加量为每孔50～150μL。
[0017]进一步的，在所述步骤(4)中，采用不完全培养基对荧光物质
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特异性抗原进行稀释，再将稀释后的荧光物质
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特异性抗原加入到步骤(3)中处理后的待筛选细胞中进行培养；
[0018]所述荧光物质
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特异性抗原的稀释倍数为100倍，按照48孔细胞培养板计算，所述荧光物质
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特异性抗原的添加量为每孔50～150μL。
[0019]进一步的，在所述步骤(2)中，特异性抗原为猪流行性腹泻病毒N蛋白，或新型冠状病毒S蛋白的受体结合域肽段。
[0020]进一步的，在所述步骤(2)中，所述荧光物质为异硫氰酸荧光素和四甲基异氰酸罗达明中的任意一种。
[0021]进一步的，所述步骤(3)中培养的时间为40～90min。
[0022]进一步的，所述步骤(4)中细胞培养的时间为30～60min。
[0023]进一步的，在所述步骤(5)的操作方法如下，在步骤(4)中处理后的待筛选细胞中加入不完全培养基，使用单细胞挑取仪观察荧光下的细胞并挑取阳性细胞，或者使用流式
细胞仪分选细胞，得到记忆B细胞和浆细胞。
[0024]上述的同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术的应用，其特征在于，用于筛本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术，其特征在于，包括以下步骤：(1)将Oleyl
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PEG4000
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NHS与金黄色葡萄球菌A蛋白偶联，得到Oleyl
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PEG4000
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NHS
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SPA；(2)用荧光物质标记特异性抗原，得到荧光物质
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特异性抗原；(3)将Oleyl
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PEG4000
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NHS
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SPA加入待筛选细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞；(4)将荧光物质
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特异性抗原加入到步骤(3)中处理后的待筛选细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行培养，然后弃上清，洗涤待筛选细胞；(5)在步骤(4)中处理后的待筛选细胞中加入不完全培养基，分选待筛选细胞，得到记忆B细胞和浆细胞。2.根据权利要求1所述的同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技术，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述Oleyl
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PEG4000
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NHS
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SPA的浓度为0.05～0.15mg/mL；按照48孔细胞培养板计算，所述Oleyl
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PEG4000
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NHS
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SPA的添加量为每孔50～150μL。3.根据权利要求1所述的同时筛选记忆B细胞和浆细胞的高效筛选技...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐勇，梁家杰，王兆广，
申请(专利权)人：广东忠信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：