一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，涉及核酸检测技术领域。本发明专利技术的核酸检测方法如下：根据待检测核酸设计正向引物和反向引物，正向引物采用生物素进行修饰，反向引物采用FITC进行修饰；或者正向引物采用FITC进行修饰，反向引物采用生物素进行修饰；以待检测核酸为模板，利用正向引物和反向引物进行RPA扩增，得到扩增产物；将扩增产物和化学发光标记物修饰的FITC抗体加入至链霉亲和素修饰的固相中，孵育，清洗后加入化学发光底物，孵育后检测化学发光信号。本发明专利技术基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，具有灵敏度高的优点，并且检测方法简单，容易实现自动化，解决了现有核酸检测方法灵敏度低和检测方法复杂的问题。方法复杂的问题。方法复杂的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法


[0001]本专利技术涉及核酸检测
，尤其涉及一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法。

技术介绍

[0002]核酸检测是体外诊断技术中最为重要的检测手段之一，核酸检测可用于检测病原菌、病毒等微生物在体内的存在，如HPV、结核病等；在基因检测方面，核酸检测可用于检测特定的基因或基因突变，从而判断个体的易感性或携带者状态，为个体化医疗提供基础数据。当前进行核酸检测主要采用的方法是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），它可以从样品中复制目标DNA段，并通过荧光指示剂来检测是否存在目标DNA序列。虽然直至今日PCR一直是很多DNA检测领域的主要工具，但是它仍然存在需要专业设备、精准的温度控制以及试剂成本高昂等缺点有待改进。
[0003]相比于PCR技术，重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）作为一种新型的体外DNA扩增技术，可以弥补PCR存在的众多不足之处。RPA反应使用重组酶（Recombinase）、单链结合蛋白(Single
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strand binding protein, SSB)和DNA聚合酶，其相对于PCR而言步骤更为简便，它利用重组酶催化两条单链DNA分子在同源区域结合，之后通过SSB保护单链DNA以维持其异质性，最后引发DNA聚合酶进行扩增反应。RPA技术结合了重组酶和聚合酶反应的优势，与PCR技术相比无需高温退火、庞大的PCR设备和复杂的实验室条件，只需简单的步骤即可快速获取核酸扩增结果，具有检测速度快、操作简单、成本低廉等优点。
[0004]使用RPA对核酸进行扩增后，可通过多种检测方法来判断目的基因的存在。Cordray等人将RPA与侧流向层析试纸条联用对疟原虫双链DNA进行检测，检出限可达到5拷贝/μL。Lau等人RPA与逆转录结合并使用荧光染料和侧流向层析试纸条检测扩增结果，实现了新冠病毒RNA的检测，检出限可达到7.659拷贝/μL。然而，侧流向层析试纸条、荧光等检测方法虽然可以简单快速的实现扩增产物检测，但是还是存在灵敏度低的缺点，难以满足实际检测种多种靶标的灵敏度需求。
[0005]化学发光作为一种灵敏度极高的信号检测方法，也有人把其应用于核酸检测。Kunze等人使用生物素标记引物进行RPA扩增，扩增产物与微阵列平表面的核酸探针杂交后，加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶和底物进行化学发光检测，但是该方法直接在固相上进行RPA扩增，效率低导致灵敏度仍然不够高，也难以用于全自动化学发光免疫分析仪实现自动化。Hu等人将RPA与CRISPR/Cas12a级联对HPV16的DNA靶标进行扩增和放大并通过化学发光法检测信号，可实现单拷贝级别的检测灵敏度，但是该体系会增加系统的复杂性并增加检测成本，同样也难以实现自动化。除此之外，上述基于化学发光的RPA技术需要把RPA引物先偶联到固相上，导致该固相无法通用，增加了研发成本和试剂成本。

技术实现思路

[0006]针对
技术介绍
提出的问题，本专利技术的目的在于提出一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，具有灵敏度高的优点，可实现单拷贝级别的检测灵敏度，并且检测方法简单，容易实现自动化，解决了现有核酸检测方法灵敏度低和检测方法复杂的问题。
[0007]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，包括以下步骤：（1）根据待检测核酸设计正向引物和反向引物，正向引物采用生物素进行修饰，反向引物采用FITC（异硫氰酸荧光素）进行修饰；或者正向引物采用FITC进行修饰，反向引物采用生物素进行修饰；以待检测核酸为模板，利用正向引物和反向引物进行RPA扩增，得到扩增产物；（2）将扩增产物和化学发光标记物修饰的FITC抗体加入至链霉亲和素修饰的固相中，孵育10~30 min，清洗后加入化学发光底物，孵育5~30 min后检测化学发光信号。
[0008]优选地，在所述步骤（1）中，当待检测核酸为DNA时，根据目标DNA设计正向引物和反向引物，在进行RPA扩增时，以目标DNA为模板进行RPA扩增；当待检测核酸为RNA时，根据目标RNA逆转录产生的cDNA设计正向引物和反向引物，在进行RPA扩增时，以目标RNA逆转录产生的cDNA为模板，进行RPA扩增。
[0009]优选地，在所述步骤（2）中，链霉亲和素修饰的固相的制备方法如下：将链霉亲和素溶于柠檬酸盐缓冲液中，配制成浓度为520 μg/mL的链霉亲和素溶液，在固相使用链霉亲和素溶液于4~ 37℃下包被反应12~24小时，用封闭液于37℃下封闭0.5~2h，得到链霉亲和素包被固相。
[0010]优选地，所述步骤（1）的操作方法如下：将T4 UvsX 蛋白、T4 UvsY蛋白、T4 gp32、聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸 、正向引物、反向引物、聚乙二醇
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35K、二硫苏糖醇、磷酸肌酸、肌酸激酶、三磷酸腺苷 、三（羟甲基）氨基甲烷、醋酸钾和醋酸镁混合制成溶液，加入待检测核酸，RPA扩增反应10~30min，获得扩增产物。
[0011]优选地，所述步骤（2）的操作方法如下：使用Tris缓冲液将化学发光标记物修饰的FITC抗体母液稀释成0.5~2 μg/mL浓度的抗体工作液，取50μL稀释100~500倍的扩增产物和50 μL化学发光标记物修饰的FITC抗体加入至链霉亲和素包被固相中，于37℃下孵育10~30 min后，检测化学发光信号。
[0012]优选地，在所述步骤（2）中，所述化学发光标记物修饰的FITC抗体为采用发光剂或酶进行修饰的FITC抗体。
[0013]优选地，所述化学发光标记物修饰的FITC抗体为吖啶脂标记抗FITC抗体、碱性磷酸酶标记抗FITC抗体和辣根过氧化物酶标记抗FITC抗体中的任意一种。
[0014]优选地，所述吖啶脂标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1~0.5 mg FITC抗体加入100 μL PBS缓冲液中，再加入20μL吖啶酯溶液混合均匀，在37℃环境进反应，对反应后的混合物使用凝胶柱进行纯化；向纯化后的溶液中加入10%BSA，直至纯化后的溶液中牛血清白蛋白的终浓度为0.5%~2%，得到吖啶脂标记抗FITC抗体。
[0015]优选地，所述碱性磷酸酶标记抗FITC抗体的制备方法如下：取0.1 ~0.5 mg FITC抗体与0.1~ 0.5 mg碱性磷酸酶混匀后，加入0.125 mL浓度为0.01% ~2%的戊二醛溶液，室温避光反应2~6小时；再加入20μL浓度为0.5 ~2 mol/L的单乙醇胺溶液，室温避光封闭反应
1~3小时；将反应后的混合物在4℃环境下使用PBS缓冲液搅拌透析过夜；向透析后的溶液中加入10%BSA，调节BSA终浓度至0.5% ~ 2%，再加入等体积甘油混匀后，得到碱性磷酸酶标记抗FITC抗体。
[0016]上述技术方案具有以下有益效果：1、本技术方案的核酸检测方法中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）根据待检测核酸设计正向引物和反向引物，正向引物采用生物素进行修饰，反向引物采用FITC进行修饰；或者正向引物采用FITC进行修饰，反向引物采用生物素进行修饰；以待检测核酸为模板，利用正向引物和反向引物进行RPA扩增，得到扩增产物；（2）将扩增产物和化学发光标记物修饰的FITC抗体加入至链霉亲和素修饰的固相中，孵育10~30 min，清洗后加入化学发光底物，孵育5~30 min后检测化学发光信号。2.根据权利要求1所述基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，在所述步骤（1）中，当待检测核酸为DNA时，根据目标DNA设计正向引物和反向引物，在进行RPA扩增时，以目标DNA为模板进行RPA扩增；当待检测核酸为RNA时，根据目标RNA逆转录产生的cDNA设计正向引物和反向引物，在进行RPA扩增时，以目标RNA逆转录产生的cDNA为模板，进行RPA扩增。3.根据权利要求1所述基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，链霉亲和素修饰的固相的制备方法如下：将链霉亲和素溶于柠檬酸盐缓冲液中，配制成浓度为520 μg/mL的链霉亲和素溶液，在固相使用链霉亲和素溶液于4~ 37℃下包被反应12~24小时，用封闭液于37℃下封闭0.5~2h，得到链霉亲和素包被固相。4.根据权利要求1所述基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在于，所述步骤（1）的操作方法如下：将T4 UvsX 蛋白、T4 UvsY蛋白、T4 gp32、聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸 、正向引物、反向引物、聚乙二醇
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35K、二硫苏糖醇、磷酸肌酸、肌酸激酶、三磷酸腺苷 、三（羟甲基）氨基甲烷、醋酸钾和醋酸镁混合制成溶液，加入待检测核酸，RPA扩增反应10~30min，获得扩增产物。5.根据权利要求1所述基于化学发光免疫分析的RPA核酸检测方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁家杰，唐勇，王誉涵，滕佩君，
申请(专利权)人：广东忠信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：