一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法，属于分子诊断技术领域。本发明专利技术通过毛细作用的原理及电荷强弱的差别，将待检样品中的核酸与其他蛋白质和细胞片段等杂质自发流动分离，目标RNA被推向芯片末端的检样区，切下检样区后在其上加入比色染料，进行扩增，通过智能手机捕捉图像来原位监测芯片的颜色变化以确认检测结果。本发明专利技术的方法具有加热充分均匀、便于保存携带、核酸分离脱杂效果好、智能手机实时检测、比色明显等显著优势。比色明显等显著优势。比色明显等显著优势。

【技术实现步骤摘要】
一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法


[0001]本专利技术涉及分子诊断
，尤其涉及一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法。

技术介绍

[0002]分子诊断已成为疾病诊断、检验检疫领域应用最广泛的
核酸检测因其具有高敏感性、特异性，在各领域得到了广泛的应用。在众多检测技术中，逆转录环介导等温扩增法(RT
‑
LAMP)具有反应过程无需变温、扩增速度快、操作简便等优点，适用于现场检测，现已在诊断领域有很多研究和应用。
[0003]但是，现有的逆转录环介导等温扩增法却仍有诸多不便。例如，其反应阶段仍需要专业人员在实验室环境下进行。虽然目前有可供户外反应使用的便捷式化学加热杯，但其仍有非实验室环境下容易出现的反应温度不均匀的问题，易导致发生其他分子和/或靶点的非特异性交叉结合，干扰结果。
[0004]在采样方面，目前仍存在采集的样品在反应前需特殊纯化处理的问题，甚至需要特定的环境保存样品。在现有的比色检测中，为了显色需要使用的试剂繁多，反应步骤过多且需要封闭的容器或暗环境，特定的激发光源等方可反应；主流的比色检测机制，例如基于链霉亲和素
‑
生物素对金纳米颗粒的结合机制在比色阶段会因与其他分子非特异性交叉结合而干扰结果。以上种种缺陷都反映了目前难以在现场快速实现准确的便携化核酸检测的现实。最新的检测手法如纸基微流控芯片仍有体积较大(所设计芯片的结构较大且复杂)，反应时间长(需固定温度加热30～40min进行RT
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LAMP反应)，设计结构复杂(需要多层结构实现吸附样品分离除杂等不同的功能)等问题，而且对样品仍有限制，较小的污染物也会影响结果判定。同时，肉眼观察对结果的确认有一定误差。
[0005]因此，建立一种可以脱离实验室环境、操作流程简单、检测灵敏精确的采检一体的现场核酸检测方法对现场快速核酸检测具有重要价值。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法，可以脱离实验室环境、操作流程简单、检测灵敏精确。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法，包括以下步骤：
[0009]将色谱纸依次进行裁剪、打蜡和加热，得到纸基微流控芯片；所述纸基微流控芯片设置有装样区、主通道过滤区和检样区，所述装样区的形状为5
×
5mm的正方形，所述主通道过滤区的形状为3
×
30mm的长方形，所述检样区的形状为直径5mm的圆形；
[0010]将待检样品加载到所述装样区，直至待检样品转移至检样区，将所述检样区对应的纸条剪下后，在所得检样区纸条上加入比色染料，进行RT
‑
LAMP反应，得到反应后检样区纸片；
[0011]采用CMOS阵列智能手机在环境照明条件下对所述反应后检样区纸片进行拍摄，将所得原始图像转化为RGB图像，使用图像处理软件比较红色光强度与绿色光强度的比值，得出核酸检测结果。
[0012]优选的，所述色谱纸为孔径20～25μm的whatmanG4级色谱纸。
[0013]优选的，在所述主通道过滤区上进行打蜡，所述加热采用加热板进行；所述加热的温度为120℃，时间为5min。
[0014]优选的，所述待检样品包括水、尿液或血浆。
[0015]优选的，所述待检样品中病毒的浓度为1～10拷贝/微升。
[0016]优选的，所述比色染料以RT
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LAMP混合液的形式使用，所述RT
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LAMP混合液由2.5μL引物与12.5μLRT
‑
LAMPColorimetricMasterMix比色染料混合组成。
[0017]优选的，在所得检样区纸条上加入比色染料后，将所得检样区纸片夹入载玻片之间密封。
[0018]优选的，所述RT
‑
LAMP反应的温度为68℃，时间为10～15min。
[0019]本专利技术提供了一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法，本专利技术通过毛细作用的原理及电荷强弱的差别，将待检样品中的核酸与其他蛋白质和细胞片段等杂质自发流动分离，目标RNA被推向芯片末端的检样区，切下检样区后在其上加入比色染料，进行扩增，通过智能手机捕捉图像来原位监测芯片的颜色变化以确认检测结果。本专利技术的方法具有加热充分均匀、便于保存携带(芯片形状尺寸小)、核酸分离脱杂效果好(待检样品利用毛细作用经过主通道流至检样区后即可完好分离杂质与核酸)、智能手机实时检测(手机拍照的清晰度足以准确分析，且能转化图像分析G/R比值)、比色明显(由原来的橘红色转变为黄色)等显著优势。本专利技术的方法检测灵敏度高(最低检测限度为1拷贝/微升)，反应速度更快(RT
‑
LAMP反应15min后即可明显区分阴阳性)。本专利技术的方法可以让非专业人员仅依靠少量试剂与材料进行采样，使用一部智能手机即可准确分析检测结果，是一种便携的采检一体的现场快速核酸检测技术。
[0020]本专利技术采用纸基微流控芯片，造价便宜，轻薄便于加热，可通过简单的蜡印制作成两端为液体流动的亲水区域和中间为经过蜡封的疏水区域。
[0021]本专利技术的原材料简单易生产，成本低廉，设计更加优化，减少了空间占用。本专利技术不需要复杂的多层结构，只需一层纸基微流控芯片，形状为长条状，尺寸小，方便加工携带。
[0022]本专利技术的采样方式简单，无需预处理样品，分离核酸过程在主通道过滤区全封闭，减少污染，只需将样品滴在检样区即可分离核酸。
[0023]进一步，本专利技术在比色阶段使用基于pH、无需额外激发光源、可在环境光下识别的比色指示试剂盒，搭配智能手机进行检测，使肉眼无法区分的可疑检测结果得到准确检测，无需试验室环境；本专利技术抛弃了其他传统的比色染料(如无色结晶紫、孔雀绿等)，且无需使用荧光染料，明显降低荧光染料产生的高成本。
[0024]进一步的，本专利技术以加热板作为加热方式，反应过程受热全面且均匀，不依赖试验室环境。
附图说明
[0025]图1为实施例1中纸基微流控芯片的制备过程示意图；
[0026]图2为实施例1中待检样品的加载过程示意图；
[0027]图3为实施例1中检样区的RT
‑
LAMP反应示意图；
[0028]图4为不同待检样品的智能手机拍照处理结果；
[0029]图5为不同待检样品的智能手机图像中绿色/红色(G/R)强度值数据图。
具体实施方式
[0030]本专利技术提供了一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法，包括以下步骤：
[0031]将色谱纸依次进行裁剪、打蜡和加热，得到纸基微流控芯片；所述纸基微流控芯片设置有装样区、主通道过滤区和检样区，所述装样区的形状为5
×
5mm的正方形，所述主通道过滤区的形状为3
×
30mm的长方形，所述检样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于纸基微流控芯片的快速核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将色谱纸依次进行裁剪、打蜡和加热，得到纸基微流控芯片；所述纸基微流控芯片设置有装样区、主通道过滤区和检样区，所述装样区的形状为5
×
5mm的正方形，所述主通道过滤区的形状为3
×
30mm的长方形，所述检样区的形状为直径5mm的圆形；将待检样品加载到所述装样区，直至待检样品转移至检样区，将所述检样区对应的纸条剪下后，在所得检样区纸条上加入比色染料，进行RT
‑
LAMP反应，得到反应后检样区纸片；采用CMOS阵列智能手机在环境照明条件下对所述反应后检样区纸片进行拍摄，将所得原始图像转化为RGB图像，使用图像处理软件比较红色光强度与绿色光强度的比值，得出核酸检测结果。2.根据权利要求1所述的快速核酸检测方法，其特征在于，所述色谱纸为孔径20～25μm的whatmanG4级色谱纸。3.根据权利要求1所述的快速核酸检测方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽良，刘世巍，范首东，高伟誉，牛敬淇，韩小虎，张燚，
申请(专利权)人：东沃同泰凤城生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：