【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种基于rpa-crispr/cas12a检测大别山病毒的引物组及其应用。
技术介绍
1、大别山病毒(大别山汉坦病毒dabieshan orthohantavirus，dbsv)是新型蜱传病毒，属于布尼亚病毒科、汉坦病毒属，因其与汉坦病毒(hantan virus,htnv)亲缘关系较近，最初被认为是汉坦病毒的一个亚型，于2015年被国际病毒分类委员会(ictv)正式命名。近年来，新型蜱传病毒因其能诱发严重的人类疾病而受到了社会上的广泛关注。虽然dbsv对人类和动物的致病性尚不清楚，但dbsv可以进行跨物种传播，且dbsv与htnv亲缘性较近，所以人们怀疑dbsv参与了人类的发热性疾病。因此，迫切需要建立分子生物学和血清学检测方法对蜱虫及人畜群体中dbsv的流行情况进行调查研究。目前针对大别山病毒检测技术主要有以下三种：
2、(1)聚合酶链式反应(pcr)技术：目前检测dbsv所使用的pcr方法包括普通pcr，巢式pcr，实时荧光定量pcr。但pcr技术在应用上仍有一定的局限。pcr作为目前的确诊手段，必须在具有复杂设备和专业操作的中心实验室中进行，然而这类诊断实验室通常远离病例所在地，在周转的过程中可能导致诊断结果延迟，这对于病毒的有效监测尤为不利。此外，由于许多样品中含有pcr反应抑制物，使得pcr检测中通常对样品前处理的要求比较严苛。
3、(2)环介导等温扩增(lamp)技术：通过降低设备要求和加快检测过程，效率更高，操作更简单。未处理的样本并不会影响lamp检测的灵敏性
4、(3)链置换扩增(sda)：sda和lamp一样，也容易污染引起非特异性扩增，而且sda不适合扩增长度超过100bp的序列。
5、以上检测方法在对dbsv的检测进行检查时，无法满足现场对dbsv快速准确地检测。因此，如何快速灵敏且特异性的检测dbsv显得尤为重要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种基于rpa-crispr/cas12a检测大别山病毒的引物组及其应用，快速灵敏且特异性的检测dbsv的引物组。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供了一种基于rpa-crispr/cas12a检测大别山病毒的引物组，所述引物组包括上游引物、下游引物、cas12a结合引物以及探针；
3、所述上游引物包括如seq id no.1所示的核苷酸序列；
4、所述下游引物包括如seq id no.2所示的核苷酸序列；
5、所述cas12a结合引物包括如seq id no.3所示的核苷酸序列；
6、所述探针的5’端利用荧光标记修饰，3’端利用生物素修饰。
7、优选的，所述探针的核苷酸序列包括5’-ttattatt-3’；所述荧光标记包括fam或fitc。
8、本专利技术还提供了上述技术方案所述的引物组在制备检测大别山病毒的试剂盒中的应用。
9、本专利技术还提供了一种检测大别山病毒的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组，还包括cas12a酶、rnase抑制剂、逆转录酶、醋酸镁溶液和缓冲液中的一种或多种。
10、优选的，所述的上游引物的独立浓度为10μm；所述下游引物的独立浓度为10μm；所述cas12a结合引物的独立浓度为1μm；所述探针的独立浓度为1.5μm。
11、本专利技术还提供了一种非诊断目的的检测大别山病毒的方法，包括如下步骤：
12、提取待测样品的基因组；
13、利用上述技术方案所述引物组中的上游引物和下游引物对所述基因组进行扩增反应，得到扩增产物；
14、将cas12a酶、所述扩增产物和上述技术方案所述引物组中的cas12a结合引物和探针混合，进行切割反应，得到rpa-crispr/cas12a反应产物；
15、利用核酸检测试纸条检测所述rpa-crispr/cas12a反应产物；
16、当核酸检测试纸条清晰显示测试线时即为阳性反应；仅显示质控线时为阴性反应。
17、优选的，所述扩增反应的条件为：37℃30min。
18、优选的，进行所述扩增反应时，以50μl的总体系计，在冻干酶管中加入primerfree rehydration buffer 29.5μl、10μm上游引物2.4μl、10μm下游引物2.4μl、基因组1μl、280mm醋酸镁2.5μl和无酶ddh2o 11.2μl；
19、所述冻干酶管中包括结合单链核酸的重组酶、单链dna结合蛋白、链置换dna聚合酶和逆转录酶。
20、优选的，所述切割反应的条件包括：37℃反应30min；
21、优选的，进行所述切割反应时，以50μl的总体系计，将1μm cas12a酶1μl、1μmcas12a结合引物5μl、1.5μm探针5μl、扩增产物5μl、1×ne buffer 5μl和余量的无菌无酶水混合。
22、有益效果：
23、本专利技术基于rpa-crispr/cas12a设计检测大别山病毒的引物组，所述引物组包括上游引物、下游引物、cas12a结合引物以及探针；所述上游引物包括如seq id no.1所示的核苷酸序列；所述下游引物包括如seq id no.2所示的核苷酸序列；所述cas12a结合引物包括如seq id no.3所示的核苷酸序列；所述探针的5’端利用荧光标记修饰，3’端利用生物素修饰。利用本专利技术提供的上游引物和下游引物可以不依赖大型仪器，在恒温条件进行dna扩增，cas12a结合引物结合cas12a酶和对扩增后的产物进行识别和切割，同时还会激活其切割非特性单链dna(ssdna)切割活性，并对非特异性单链dna(即探针)进行切割，利用蓝光照射或试纸条对切割后产物进行检测即可判断是否存在大别山病毒。本专利技术提供的引物组能同时保证检测的灵敏度与特异性，快速检测大别山病毒。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大别山病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物、下游引物、Cas12a结合引物以及探针；
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述探针的核苷酸序列包括5’-TTATTATT-3’；所述荧光标记包括FAM或FITC。
3.权利要求1或2所述的引物组在制备检测大别山病毒的试剂盒中的应用。
4.一种检测大别山病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组，还包括Cas12a酶、逆转录酶、醋酸镁溶液和缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的上游引物的独立浓度为10μM；所述下游引物的独立浓度为10μM；所述Cas12a结合引物的独立浓度为1μM；所述探针的独立浓度为1.5μM。
6.一种非诊断目的的检测大别山病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增反应的条件为：37℃30min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进行所述扩增反应时，以50
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述切割反应的条件包括：37℃反应30min。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进行所述切割反应时，以50μL的总体系计，将1μM Cas12a酶1μL、1μM Cas12a结合引物5μL、1.5μM探针5μL、扩增产物5μL、1×NEBuffer 5μL和余量的无菌无酶水混合。
...【技术特征摘要】
1.一种基于rpa-crispr/cas12a检测大别山病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物、下游引物、cas12a结合引物以及探针；
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述探针的核苷酸序列包括5’-ttattatt-3’；所述荧光标记包括fam或fitc。
3.权利要求1或2所述的引物组在制备检测大别山病毒的试剂盒中的应用。
4.一种检测大别山病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组，还包括cas12a酶、逆转录酶、醋酸镁溶液和缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的上游引物的独立浓度为10μm；所述下游引物的独立浓度为10μm；所述cas12a结合引物的独立浓度为1μm；所述探针的独立浓度为1.5μm。
6.一种非诊断目的的检测大别山病毒的方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽良，韩小虎，范首东，崔扬书翰，张燚，焦洋，祁安东，
申请(专利权)人：东沃同泰凤城生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。