【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种基于rpa-crispr/cas12a检测新布尼亚病毒的引物组及其应用。
技术介绍
1、发热伴血小板减少综合征(sfts)是由新布尼亚病毒(sftsv)感染，由蜱叮咬而传播的一种新发急性传染病。该病典型的临床症状为严重发热、血小板和白细胞减少，死亡率较高。中国东北地势多山，生物资源丰富，地理复杂和气候多变造成物种的丰富和多样性，为蜱虫的生存和繁殖提供了生态和生物基础。该病近年来病例数逐年递增，对人群健康尤其是农民造成了巨大的威胁。
2、随着sftsv病原的检测方法不断发展，除了各种基于pcr的核酸检测方法外，人们还建立了不同等温扩增检测方法，但pcr方法需要昂贵的热循环仪，且过程中受不同温度的严格限制，且需要先进行样本的处理，操作比较繁琐；环介导的等温扩增(lamp)和pcr技术相比，扩增的效率更高，操作简单，使用的酶较少，不需要预扩增连接过程，但容易导致非特异性扩增。链置换扩增(sda)和lamp一样，也容易污染引起非特异性扩增，而且sda不适合扩增长度超过100bp的序列。以上检测方法在对sftsv的检测进行检查时，无法满足现场对sftsv快速准确地检测。因此，如何快速灵敏且特异性的检测sftsv显得尤为重要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于弥补现有技术的不足，提供一种基于rpa-crispr/cas12a检测新布尼亚病毒的引物组及其应用，快速、灵敏且特异性的检测sftsv。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供了
3、所述rpa上游引物包括如seq id no.1所示的核苷酸序列；
4、所述rpa下游引物包括如seq id no.2所示的核苷酸序列；
5、所述crrna包括如seq id no.3所示的核苷酸序列；
6、所述单链报告分子的5’端利用荧光标记修饰，3’端利用生物素修饰。
7、优选的，所述单链报告分子的核苷酸序列包括5’-ttattatt-3’；所述荧光标记包括fam或fitc。
8、本专利技术还提供了上述技术方案所述的引物组在制备检测新布尼亚病毒的试剂盒中的应用。
9、本专利技术还提供了一种检测新布尼亚病毒的试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组，还包括cas12a酶、rnase抑制剂、逆转录酶、醋酸镁溶液和缓冲液中的一种或多种。
10、优选的，所述的rpa上游引物的独立浓度为10μm；所述rpa下游引物的独立浓度为10μm；所述crrna的独立浓度为1μm；所述单链报告分子的独立浓度为1.5μm。
11、本专利技术还提供了一种非诊断目的的检测新布尼亚病毒的方法，包括如下步骤：
12、提取待测样品的基因组；
13、利用上述技术方案所述引物组中的rpa上游引物和rpa下游引物对所述基因组进行扩增反应，得到扩增产物；
14、将cas12a酶、所述扩增产物和上述技术方案所述引物组中的crrna和单链报告分子混合，进行切割反应，得到rpa-crispr/cas12a反应产物；
15、利用核酸检测试纸条检测所述rpa-crispr/cas12a反应产物；
16、当核酸检测试纸条测试线和质控线均产生带有颜色的条带，或只有测试线产生带有颜色的条带，则为阳性反应；当只有质控线产生带有颜色的条带，测试线处无颜色变化，则为阴性反应。
17、优选的，所述扩增反应的条件包括：37℃30min；
18、优选的，进行所述扩增反应时，以50μl的总体系计，在冻干酶管中加入无引物再水合缓冲液29.5μl、10μm rpa上游引物2.4μl、10μm rpa下游引物2.4μl、250mm醋酸镁2.5μl、2μl基因组和11.2μl水；
19、所述冻干酶管中包括结合单链核酸的重组酶、单链dna结合蛋白、链置换dna聚合酶和逆转录酶。
20、优选的，所述切割反应的条件包括：37℃反应30min。
21、优选的，进行所述切割反应时，以50μl的总体系计，将1μm cas12a酶1μl、1μmcrrna 5μl、1.5μm单链报告分子5μl、扩增产物5μl、1×ne buffer 5μl和余量的无菌无酶水混合。
22、有益效果：
23、本专利技术基于rpa-crispr/cas12a设计检测新布尼亚病毒的引物组，所述引物组包括rpa上游引物、rpa下游引物、crrna以及单链报告分子；所述rpa上游引物包括如seq idno.1所示的核苷酸序列；所述rpa下游引物包括如seq id no.2所示的核苷酸序列；所述crrna包括如seq id no.3所示的核苷酸序列；所述单链报告分子的5’端利用荧光标记修饰，3’端利用生物素修饰。利用本专利技术提供的rpa上游引物和rpa下游引物可以不依赖大型仪器，在恒温条件进行dna扩增，利用crrna结合cas12a酶，对扩增后的产物进行识别和切割，同时还会激活cas12a酶切割非特性单链dna(即单链报告分子)切割活性，使cas12a酶对非特异性单链dna进行切割，利用蓝光照射或试纸条对切割后产物进行检测即可判断是否存在新布尼亚病毒。本专利技术提供的引物组能同时保证检测的灵敏度与特异性，快速检测新布尼亚病毒。
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1.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测新布尼亚病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括RPA上游引物、RPA下游引物、crRNA和单链报告分子；
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述单链报告分子的核苷酸序列包括5’-TTATTATT-3’；所述荧光标记包括FAM或FITC。
3.权利要求1或2所述的引物组在制备检测新布尼亚病毒的试剂盒中的应用。
4.一种检测新布尼亚病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组，还包括Cas12a酶、逆转录酶、醋酸镁溶液和缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的RPA上游引物的独立浓度为10μM；所述RPA下游引物的独立浓度为10μM；所述crRNA的独立浓度为1μM；所述单链报告分子的独立浓度为1.5μM。
6.一种非诊断目的的检测新布尼亚病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增反应的条件包括：37℃30min。
8.根据权利要求6或7所述的方法
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述切割反应的条件包括：37℃反应30min。
10.根据权利要求6或9所述的方法，其特征在于，进行所述切割反应时，以50μL的总体系计，将1μM Cas12a酶1μL、1μM crRNA 5μL、1.5μM单链报告分子5μL、扩增产物5μL、1×NEBuffer 5μL和余量的无菌无酶水混合。
...【技术特征摘要】
1.一种基于rpa-crispr/cas12a检测新布尼亚病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括rpa上游引物、rpa下游引物、crrna和单链报告分子；
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述单链报告分子的核苷酸序列包括5’-ttattatt-3’；所述荧光标记包括fam或fitc。
3.权利要求1或2所述的引物组在制备检测新布尼亚病毒的试剂盒中的应用。
4.一种检测新布尼亚病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组，还包括cas12a酶、逆转录酶、醋酸镁溶液和缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的rpa上游引物的独立浓度为10μm；所述rpa下游引物的独立浓度为10μm；所述crrna的独立浓度为1μm；所述单链报告分子的独立浓度为1.5μm。
6.一种非诊断目...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽良，韩小虎，范首东，崔扬书翰，张燚，焦洋，祁安东，
申请(专利权)人：东沃同泰凤城生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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