【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗真菌活性物质开发，尤其涉及解淀粉芽孢杆菌b10抗真菌活性蛋白、制备方法及其应用。
技术介绍
1、黄曲霉(aspergillus flavus)是自然界内一种常见的曲霉属腐生型土壤真菌。其在土壤中主要以菌核或分生孢子的形式存在，在适宜的条件下，通过产生分生孢子的方式，广泛的在植物、农作物、粮制品及其它易霉腐的有机物上传播。黄曲霉的结构特性导致其在受到外界刺激(如高温干旱)时，会产生一些有毒的次级代谢产物如黄曲霉毒素(aflatoxins)、环匹阿尼酸(cyclopiazonicacid)、黄曲霉震颤素(aflatrem)等。黄曲霉毒素是有史以来毒性最强、致肝癌性最强的天然化合物，国际癌症研究机构(iarc)将其划分为一类致癌物。沾染黄曲霉毒素是作物、农副产品及饲料污染的主要原因。花生、无花果、玉米、油籽、高粱、可可豆、香料、大米、水果和蔬菜等产品都容易受到黄曲霉毒素的污染。食品中黄曲霉毒素检出率的居高不下给人们带来了极大的安全保障压力，一旦发现黄曲霉毒素污染将面临巨大经济损失和一系列安全问题。物理和化学防治方法存在效率低、破坏食品和饲料的问题。
2、抗真菌活性物质主要源于动物、植物、微生物在生命活动中所产生的次级代谢产物和副产物，其按化学性质可大致分成以下几种类别如：酶、肽等活性蛋白类物质；抗生素、细菌素及其类似物；氨类、醛类、聚酮类、有机酸等水溶性或挥发性化合物和衍生物等。而微生物以其种类繁多，繁殖速度快、有效成分提纯便利等优势逐渐成为人们获取抗真菌活性物质的主要生力军。大部分活性物质来源于菌株的无菌
3、在抑制或杀灭病原真菌方面，抗菌活性物质作用效果主要表现在抑制菌丝生长，影响孢子萌发或使其破裂，使菌丝或孢子肿大、扭曲、畸形等。通过对真菌细胞壁、细胞膜、细胞器等细胞结构的破坏，对病原真菌的生存能力产生不同程度的影响。例如，β-葡聚糖是真菌细胞壁的主要多糖，对细胞有支撑作用，其表面的多种特异性受体对真菌识别和诱导宿主免疫反应有重要意义。一些棘白菌素类药物(如卡泊芬净、米卡芬净等)是β-(1，3)-葡聚糖合酶的非竞争性抑制剂，通过影响葡聚糖的合成，破坏真菌细胞壁。相较于传统的物理化学方法，具有环境友好、操作处理条件温和、易于产业化等优势。
4、基于此，挖掘新型抗真菌蛋白并建立其在抗黄曲霉中的应用方法具有重要意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供解淀粉芽孢杆菌b10抗真菌活性蛋白、制备方法及其应用，能够抑制产毒型黄曲霉的生长或繁殖。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
3、解淀粉芽孢杆菌b10的抗真菌活性蛋白，所述解淀粉b10的保藏号为cctccno:m2018353；抗真菌活性蛋白b10-glu的氨基酸序列如seq id no.2所示，抗真菌活性蛋白b10-lci的氨基酸序列如seq id no.4所示。
4、本专利技术还提供了两种抗真菌活性蛋白b10-glu和b10-lci的编码基因，所述抗真菌活性蛋白b10-glu编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述抗真菌活性蛋白b10-lci编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
5、本专利技术还提供了所述抗真菌活性蛋白或所述编码基因在抑制产毒型黄曲霉生长、繁殖中的应用。
6、本专利技术还提供了含有所述编码基因的重组载体及克隆感受态细胞。
7、本专利技术还提供了抗真菌活性蛋白b10-glu或b10-lci的制备方法，包括以下步骤：设计引物，以解淀粉芽孢杆菌b10 dna为模板，进行pcr反应扩增得到抗真菌活性目的基因片段；构建重组载体并通过感受态细胞进行目的蛋白克隆表达。
8、优选的是，所述抗真菌活性蛋白b10-glu引物的上游引物f的核苷酸序列如seq idno.5所示，下游引物r的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述抗真菌活性蛋白b10-lci引物的上游引物f的核苷酸序列如seq id no.7所示，下游引物r的核苷酸序列如seq id no.8所示。
9、优选的是，所述目的蛋白为抗真菌活性蛋白b10-glu时，感受态细胞的培养条件为25℃诱导12h；所述目的蛋白为抗真菌活性蛋白b10-lci时，感受态细胞的培养条件为16℃诱导16h。
10、优选的是，还包括得到蛋白液后，经过浓缩、离心，取上清液进行亲和层析纯化；更优选的是，所述亲和层析纯化时，利用200-300mm咪唑溶液洗脱
11、相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
12、本专利技术提供了两种抗真菌活性蛋白b10-glu和b10-lci及其制备方法，并对其抑菌作用方式进行探究，为采用生物防控技术防控饲料中黄曲霉污染提供了新的思路和理论依据。
13、通过一系列抑制黄曲霉毒特性试验，对抗菌蛋白抑制黄曲霉生长的最适温度、ph及其他反应条件有了初步了解，为接下来定向改造抗菌蛋白以提高其抑菌效果提供了理论支持，为日后的临床试验、蛋白量产及抗黄曲霉新药的研发提供了理论基础。
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1.解淀粉芽孢杆菌B10的抗真菌活性蛋白，其特征在于，所述解淀粉B10的保藏号为CCTCCNO:M2018353；抗真菌活性蛋白B10-Glu的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，抗真菌活性蛋白B10-LCI的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的抗真菌活性蛋白的编码基因，其特征在于，所述抗真菌活性蛋白B10-Glu编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗真菌活性蛋白B10-LCI编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.权利要求1所述的抗真菌活性蛋白或权利要求2所述的编码基因在抑制产毒型黄曲霉生长、繁殖中的应用。
4.含有权利要求2所述的编码基因的重组载体。
5.含有权利要求2所述的编码基因的克隆感受态细胞。
6.权利要求1所述的抗真菌活性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：设计引物，以解淀粉芽孢杆菌B10 DNA为模板，进行PCR反应扩增得到抗真菌活性目的基因片段；构建重组载体并通过感受态细胞进行目的蛋白克隆表达。
7.根据权利要求6所述的抗
8.根据权利要求6所述的抗真菌活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述目的蛋白为抗真菌活性蛋白B10-Glu时，感受态细胞的培养条件为25℃诱导12h；所述目的蛋白为抗真菌活性蛋白B10-LCI时，感受态细胞的培养条件为16℃诱导16h。
9.根据权利要求6所述的抗真菌活性蛋白的制备方法，其特征在于，还包括得到蛋白液后，经过浓缩、离心，取上清液进行亲和层析纯化。
10.根据权利要求9所述的抗真菌活性蛋白的制备方法，其特征在于，所述亲和层析纯化时，利用200-300mM咪唑溶液洗脱。
...【技术特征摘要】
1.解淀粉芽孢杆菌b10的抗真菌活性蛋白，其特征在于，所述解淀粉b10的保藏号为cctccno:m2018353；抗真菌活性蛋白b10-glu的氨基酸序列如seq id no.2所示，抗真菌活性蛋白b10-lci的氨基酸序列如seq id no.4所示。
2.权利要求1所述的抗真菌活性蛋白的编码基因，其特征在于，所述抗真菌活性蛋白b10-glu编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述抗真菌活性蛋白b10-lci编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
3.权利要求1所述的抗真菌活性蛋白或权利要求2所述的编码基因在抑制产毒型黄曲霉生长、繁殖中的应用。
4.含有权利要求2所述的编码基因的重组载体。
5.含有权利要求2所述的编码基因的克隆感受态细胞。
6.权利要求1所述的抗真菌活性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：设计引物，以解淀粉芽孢杆菌b10 dna为模板，进行pcr反应扩增得到抗真菌活性目的基因片段；构建重组载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：龙淼，陈泽良，李天溪，熊东炜，范首东，
申请(专利权)人：东沃同泰凤城生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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