【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体为一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒及其制备方法和应用。
技术介绍
1、牛病毒性腹泻(bovineviraldiarrhoea/mucosaldisease)是由牛病毒性腹泻病毒(bvdv)引起的以粘膜发炎、糜烂、坏死和腹泻为特征的一种传染性疾病，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高。然而，该病至今尚无有效治疗和免疫方法，只有加强护理和对症疗法，增强机体抵抗力，促使病牛康复。
2、直至目前，应用疫苗防控bvd仍然是重要的方法。1960年bvdv疫苗开始生产，随着生物技术的发展，现如今已研制出多种类型的bvdv疫苗，其中，亚单位疫苗，尤其是多表位疫苗的研发取得了飞跃的进展。然而，仍然有部分表位肽存在体内容易降解、免疫原性较低的问题，这使得免疫细胞上的受体难以识别表位肽并刺激相应的免疫反应，从而导致产生的抗体滴度较低，难以产生较好的预防效果。而在bvdv基因组中e2、e0基因所编码的蛋白是bvdv的2个主要保护性抗原，均可用于基因工程疫苗的研究。e2基因保守性低，变异率高，所编码的蛋白具有较强的免疫原性；而e0基因高度保守并且抗原性也很强，已逐渐成为研制bvdv基因工程疫苗的候选者。
3、卵黄抗体是一种通过免疫接种产蛋母鸡，由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗的抗体，具有制备简单、产量大、成本低、易保存与运输等优势。卵黄抗体的制备，需要对鸡进行高效免疫并持续产生高水平的抗体，因此，卵黄抗体制备所用的抗原是影响抗体制备的关键因素。现有制备卵黄抗体，一般仍采用传统
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，以耐热蛋白纳米颗粒作为支架，构建同时偶联bvdv的2个抗原的新型疫苗抗原，使疫苗具备多价、耐热、强免疫原的特征。
2、本专利技术目的还在于提供一种所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原的应用，所获得的卵黄抗体具有滴度高、亲合力强的特点，能够有效中和bvdv病毒。
3、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
4、本专利技术提供了一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原包括e0重组蛋白、e2重组蛋白和耐热纳米颗粒aals；编码e0重组蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示；编码e0重组蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示；编码耐热纳米颗粒aals的核苷酸序列如seq id no.3所示。
5、优选地，所述e0重组蛋白和/或e2重组蛋白的氨基端含有spytag，所述e0重组蛋白和/或e2重组蛋白的羧基端含有组氨酸标签。
6、优选地，所述耐热纳米颗粒aals含有spycatcher。
7、优选地，所述e0重组蛋白和/或e2重组蛋白的制备方法包括如下步骤：以bvdv-1gs5株的e0和/或e2基因序列作为重组表达基因，将上述e0和/或基因序列连接至pet21b表达载体获得重组载体pet21b-e0和/或pet21b-e2，并通过体外重组表达和纯化获得e0重组蛋白和/或e2重组蛋白。
8、优选地，所述体外重组表达包括如下步骤：将重组载体pet21b-e0和/或pet21b-e2转化到大肠杆菌bl21后在固体lb培养基上培养过夜，挑单菌落转入液体lb培养基中培养过夜后获得大肠杆菌单克隆种子菌；将获得的种子菌加入液体lb培养基中扩大培养后，加入iptg诱导剂诱导目的蛋白表达。
9、本专利技术提供了一种所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原的制备方法，包括如下步骤：将e0重组蛋白和e2重组蛋白与耐热纳米颗粒蛋白aals以摩尔比1～1.5:1～1.5:1～3于pbs中性缓冲液中偶联即可获得牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原。
10、优选地，所述e0重组蛋白和/或e2重组蛋白的氨基端的spytag与耐热纳米颗粒aals支架上的spycatcher连接。
11、本专利技术还提供了一种免疫组合物，包括所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原和医学上可接受的佐剂。
12、优选地，将所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原与佐剂等体积比例混合后，使用磁力搅拌器在低剪切力200～300rpm下搅拌2～5h左右即可。
13、本专利技术还提供了一种所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原或所述的免疫组合物在制备卵黄抗体中的应用。
14、相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
15、本专利技术以耐热纳米颗粒为支架，同时耦连两个bvdv重要保护性抗原e0与e2，显著高了疫苗抗原的稳定性以及疫苗的免疫原性；本专利技术以构建的多价耐热纳米颗粒抗原作为免疫原，免疫制备卵黄抗体，以更小的成本从鸡蛋中提取更高产量、更高效价、更易保存、更高亲和力的卵黄抗体，制备的卵黄抗体能够有效中和bvdv病毒。
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1.一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原包括E0重组蛋白、E2重组蛋白和耐热纳米颗粒AaLS；编码E0重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码E0重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码耐热纳米颗粒AaLS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的氨基端含有Spytag，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的羧基端含有组氨酸标签。
3.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述耐热纳米颗粒AaLS含有Spycatcher。
4.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的制备方法包括如下步骤：以BVDV-1GS5株的E0和/或E2基因序列作为重组表达基因，将上述E0和/或E2基因序列连接至pET21b表达载体获得重组载体pET21b-E0和/或pET21b-E2，并通过体外重组表达和纯化获得E0重组
5.根据权利要求4所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述体外重组表达包括如下步骤：将重组载体pET21b-E0和/或pET21b-E2转化到大肠杆菌BL21后在固体LB培养基上培养过夜，挑单菌落转入液体LB培养基中培养过夜后获得大肠杆菌单克隆种子菌；将获得的种子菌加入液体LB培养基中扩大培养后，加入IPTG诱导剂诱导目的蛋白表达。
6.权利要求1～5任意一项所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将E0重组蛋白和E2重组蛋白与耐热纳米颗粒蛋白AaLS以摩尔比1～1.5:1～1.5:1～3于PBS中性缓冲液中偶联即可获得牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述E0重组蛋白和/或E2重组蛋白的氨基端的Spytag与耐热纳米颗粒AaLS支架上的Spycatcher连接。
8.一种免疫组合物，其特征在于，包括权利要求1～5任意一项所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原和医学上可接受的佐剂。
9.权利要求8所述免疫组合物的制备方法，其特征在于，将所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原与佐剂等体积比例混合后，使用磁力搅拌器在低剪切力200～300rpm下搅拌2～5h左右即可。
10.权利要求1～5任意一项所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原或权利要求8或9所述的免疫组合物在制备卵黄抗体中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原包括e0重组蛋白、e2重组蛋白和耐热纳米颗粒aals；编码e0重组蛋白的核苷酸序列如seq id no.1所示；编码e0重组蛋白的核苷酸序列如seq id no.2所示；编码耐热纳米颗粒aals的核苷酸序列如seq id no.3所示。
2.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述e0重组蛋白和/或e2重组蛋白的氨基端含有spytag，所述e0重组蛋白和/或e2重组蛋白的羧基端含有组氨酸标签。
3.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述耐热纳米颗粒aals含有spycatcher。
4.根据权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述e0重组蛋白和/或e2重组蛋白的制备方法包括如下步骤：以bvdv-1gs5株的e0和/或e2基因序列作为重组表达基因，将上述e0和/或e2基因序列连接至pet21b表达载体获得重组载体pet21b-e0和/或pet21b-e2，并通过体外重组表达和纯化获得e0重组蛋白和/或e2重组蛋白。
5.根据权利要求4所述的牛病毒性腹泻病毒纳米颗粒抗原，其特征在于，所述体外重组表达包括如下步骤：将重...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈泽良，范首东，张燚，张岩，来永豪，韩小虎，祈安东，
申请(专利权)人：东沃同泰凤城生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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