高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法及其应用，涉及免疫学技术领域。本发明专利技术的方法通过将Oleyl

【技术实现步骤摘要】
高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及免疫学
，尤其涉及一种高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法及其应用。

技术介绍

[0002]单克隆抗体是指由单一细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。1974年首次由德国科学家Kohler和英国科学家Milstein成功将骨髓瘤细胞和产生抗体的B淋巴细胞融合为杂交瘤细胞，并因此获得1984年诺贝尔生理学及医学奖。杂交瘤细胞既具有可产生只针对某一特定抗原决定簇的单克隆抗体的B淋巴细胞特性，同时也具有骨髓瘤细胞无限增殖的特性。杂交瘤技术的建立开创了抗体制备的新方法。单克隆抗体广泛应用于纯化蛋白、生物体内示踪、肿瘤诊断分型、病原体及抗体的检测、细胞分化阶段的判断、肿瘤及病毒感染的治疗等领域，具有广阔的市场空间和应用价值。与兔源、人源单克隆抗体相比，鼠源单克隆抗体应用广泛、技术成熟、成本低、可长期大规模生产。所选用的BALB/c小鼠品系单一，遗传背景清楚，因此可以长期获得稳定、一致的抗体。
[0003]目前传统的鼠源单克隆抗体制备方法主要是杂交瘤技术，但是传统的基于有限稀释与ELISA的筛选方法对于阳性细胞的筛选非常复杂和低效。随后有专利报道可在骨髓瘤细胞和脾脏细胞融合后，先对杂交瘤细胞克隆进行特异性细胞染色，然后手工挑取特定细胞克隆从而获得特异性杂交瘤细胞克隆，这种方法相对于传统的基于有限稀释与ELISA的方法，其筛选效率大幅提高，但其仍具有以下缺点：(1)融合细胞阳性率低：由于脾细胞中特异性浆细胞数量较少、脾细胞和骨髓瘤细胞融合后的阳性细胞比例低，因此长出的阳性克隆的比例少。(2)耗费细胞量多：使用培养板培养基等耗材多，由于特异性阳性浆细胞数量在脾细胞中的比例少，因此需要用尽量多的脾细胞和对应比例的SP2/0细胞来进行融合，耗费量大。(3)实验周期长，操作中易丢失阳性细胞株：融合后的杂交瘤细胞团先在荧光显微镜下观察，进行标记，之后再手动挑取。由于是手工挑取因此需要细胞克隆长的较大才能进行，因此需要的时间较长(14
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28天)，且容易在挑取的过程中丢失阳性细胞团。

技术实现思路

[0004]针对
技术介绍
提出的问题，本专利技术的目的在于提出一种高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，能够能够快速、简便筛选分泌特异性抗体的浆细胞，将浆细胞直接和骨髓瘤细胞进行融合，便可形成分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，不仅能有效减少消耗的骨髓瘤细胞的数量，而且能够显著提高阳性细胞比例，准确率高，同时能大大缩短杂交瘤细胞的筛选时间，减少克隆化的次数，避免阳性细胞株的丢失。
[0005]本专利技术的另一目的在于提出一种高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法在制备鼠源单克隆抗体中应用，能显著缩短单克隆抗体制备周期。
[0006]为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]一种高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，包括以下步骤：
[0008](1)将Oleyl
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PEG
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NHS与抗原偶联，得到Oleyl
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PEG
‑
NHS
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抗原；
[0009](2)将脾脏细胞清洗后，加入Oleyl
‑
PEG
‑
NHS
‑
抗原，于37℃、5％CO2的条件下进行孵育，然后弃上清，清洗脾脏细胞；
[0010](3)将荧光物质标记的抗鼠二抗加入到步骤(2)处理好的脾脏细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行孵育，然后弃上清，清洗脾脏细胞；
[0011](4)将脾脏细胞通过流式细胞仪分选，分选出带荧光标记的细胞，即为分泌特异性抗体的浆细胞；
[0012](5)将浆细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；
[0013](6)将杂交瘤细胞按照步骤(2)和步骤(3)进行染色后，用单细胞挑取仪对具有强荧光的杂交瘤细胞进行挑取，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0014]进一步，在所述步骤(1)中，所述抗原为CDKN2A
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P16蛋白或PEDV
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N蛋白。
[0015]进一步，在所述步骤(2)中，按96孔板计算，所述Oleyl
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PEG
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NHS
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抗原的加入量为每孔添加200μg。
[0016]进一步，在所述步骤(5)中，所述浆细胞与所述骨髓瘤细胞进行融合时，浆细胞的细胞数和骨髓瘤细胞的细胞数的比例为1：5～1：10。
[0017]进一步，在所述步骤(3)中，所述荧光物质为异硫氰酸荧光、AF647和别藻蓝蛋白中的任意一种。
[0018]进一步，在所述步骤(3)中，所述抗鼠二抗为羊抗鼠IgGFc二抗。
[0019]进一步，所述步骤(2)中孵育的时间为30～180min；
[0020]所述步骤(3)中孵育的时间为30～180min。
[0021]进一步，所述步骤(2)和所述步骤(3)中分别使用磷酸盐缓冲液或1640基础培养基清洗脾脏细胞。
[0022]根据上述的高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法在制备鼠源单克隆抗体中应用。
[0023]上述技术方案具有以下有益效果：
[0024]1、本技术方案通过一种两亲性物质(Oleyl
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PEG
‑
NHS)结合流式分选和显微单细胞挑取仪，能够快速、简便筛选分泌特异性抗体的浆细胞，将能够分泌特异性抗体的浆细胞直接和骨髓瘤细胞进行融合，形成分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，不仅能有效减少消耗的骨髓瘤细胞的数量，而且能够显著提高阳性细胞比例，准确率95％以上，准确率高，同时能大大缩短杂交瘤细胞的筛选时间，减少克隆化的次数，避免阳性细胞株的丢失。
[0025]2、提高融合细胞阳性率，减少细胞耗费量，两亲性物质(Oleyl
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PEG
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NHS)能够锚定在细胞膜的磷脂双分子层上，再偶联抗原后，浆细胞所分泌的抗体可与偶联物中的抗原结合，再加入荧光二抗(即荧光物质标记的抗鼠二抗)与分泌抗体结合，即可通过流式细胞仪将带荧光的细胞分选出来，即为单个特异性浆细胞，通过流式细胞仪从脾细胞群中挑取出特异性浆细胞后，只将特异性浆细胞与骨髓瘤细胞进行融合，融合后的阳性率大幅提高，同时大幅减少了脾脏细胞的使用量，同比大幅减少了骨髓瘤细胞的使用量；
[0026]3、缩短实验周期，降低实验要求，提高挑取成功率，通过显微单细胞挑取仪可直接获得分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤单细胞或小克隆团，细胞培养的时间可以大幅缩短，能显著缩短单克隆抗体制备周期，同时用单细胞挑取仪能够实现对阳性细胞的精细挑取，
降低对实验操作人员的要求，有效避免挑取失误。
附图说明
[0027]图1是本专利技术一个实施例的高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法的原理图；
[0028]图2是实施例1采用EL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将Oleyl
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PEG
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NHS与抗原偶联，得到Oleyl
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PEG
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NHS
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抗原；(2)将脾脏细胞清洗后，加入Oleyl
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PEG
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NHS
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抗原，于37℃、5％CO2的条件下进行孵育，然后弃上清，清洗脾脏细胞；(3)将荧光物质标记的抗鼠二抗加入到步骤(2)处理好的脾脏细胞中，于37℃、5％CO2的条件下进行孵育，然后弃上清，清洗脾脏细胞；(4)将脾脏细胞通过流式细胞仪分选，分选出带荧光标记的细胞，即为分泌特异性抗体的浆细胞；(5)将浆细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；(6)将杂交瘤细胞按照步骤(2)和步骤(3)进行染色后，用单细胞挑取仪对具有强荧光的杂交瘤细胞进行挑取，得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。2.根据权利要求1所述的高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述抗原为CDKN2A
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P16蛋白或PEDV
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N蛋白。3.根据权利要求2所述的高效筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐勇，梁家杰，杜祎凡，
申请(专利权)人：广东忠信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：