一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌

【技术实现步骤摘要】
一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌的方法及应用


[0001]本专利技术属于微生物检测
，尤其是一种基于Argonaute可视化检测耐药菌的方法、装置及其应用，特别是一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌
‑
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法及装置，命名为STAR(Simultaneous dual
‑
gene Test ofmethicillin
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resistant Staphylococcus aureus based on Argonaute
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powered poRtable andvisual biosensor)。

技术介绍

[0002]临床治疗中对抗菌药物的广泛使用导致病原菌耐药性逐年提高，对常见传染病的治疗产生了重大影响。世界卫生组织宣布，微生物耐药性是世界十大公共卫生威胁之一。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种对β
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内酰胺类药物具有耐药性的革兰氏阳性菌，医院感染和公共感染最重要的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于PfAgo结合LAMP扩增一管法同时双靶点检测耐药菌
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(1)提取待检测菌的基因组；(2)选择耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA的基因组中特异性基因nuc和mecA序列设计用于MRSA检测的LAMP引物；(3)将混合的LAMP扩增体系放置于65℃孵育30min，得到LAMP扩增产物；(4)将LAMP扩增产物加入PfAgo反应体系中，在95℃孵育15min，反应结束后通过酶标仪进行荧光值测量，或者将反应管放置于3D检测装置中，获得检测结果；当双靶标同时存在，与阴性对照组即无靶标的荧光值相比，阳性组即有靶标的双荧光皆有增长，且在302nm紫外照射下为黄色荧光，则证明检测菌为MRSA，否则证明无MRSA。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：每总体积为25μL的LAMP扩增体系具体如下：Buffer2.5μL，10
×
引物mix
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nuc基因扩增2.5μL，10
×
引物mix
‑
mecA基因扩增2.5μL，dNTPsmix3.5μL，100mMMgSO42μL，BstDNA聚合酶0.5μL，待检测菌的基因组2μL，ddH2O9.5μL；其中，Buffer成分为：200mMTris
‑
HCl，pH8.8，500mM氯化钾，100mM硫酸铵，20mM硫酸镁，质量浓度为1％的Tween
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20；10
×
引物mix
‑
nuc基因扩增包括：16μMFIP，16μMBIP，2μMF3，2μMB3，4μMLoop F，4μMLoopB；FIP、BIP、F3、B3、LoopF、LoopB的基因序列依次为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6；10
×
引物mix
‑
mecA基因扩增包括：16μMFIP，16μMBIP，2μMF3，2μMB3，4μMLoop F，4μMLoopB；FIP、BIP、F3、B3、LoopF、LoopB的基因序列依次为SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.12；dNTPsmix包括：10mMdATP，10mMdTTP，10mMdCTP，10mMdGTP，10mMdUTP。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PfAgo反应体系为：6μMPfAgo，0.5μM、nuc基因引导DNAs，0.5μM、mecA基因引导DNAs，0.2μM荧光探针A，0.2μM荧光探针B以及反应缓冲液；其中，nuc基因引导DNAs包括3条相应的引导DNA即guideDNA1、guideDNA2、guide DNA3，三条guideDNA总浓度为0.5μM，三条guideDNA的摩尔浓度比为1:1:1，三条guide DNA的基因序列依次为SEQ ID NO.21至SEQ ID NO.23；所述荧光探针A的基因序列为SEQ ID NO.24；mecA基因引导DNAs包括3条相应的引导DNA即guideDNA1、guideDNA2、guide DNA3，三条guideDNA总浓度为0.5μM，三条guideDNA的摩尔浓度比为1:1:1，三条guide DNA的基因序列依次为SEQ ID NO.25至SEQ ID NO.27；所述荧光探针B的基因序列为SEQ ID NO.28；所述反应缓冲液的组成为：pH7.5的HEPES、NaCl和MnCl2的混合液，Hepes
‑
NaOH：NaCl：MnCl2的摩尔比为20：100：0.5；Hepes
‑
NaOH与PfAgo的摩尔比为20：6；或者，所述荧光探针A为与ssDNAA互补的5
’
ROX和3
’
BHQ2双标记；所述荧光探针B为与ssDNAB互补的5
’
FAM和3
’
BHQ1双标记。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法通过当靶标DNA存在时，PfAgo能够在引导DNA的引导下切割靶标DNA，产生的次级ssDNA，能够作为新的引导DNA与空
‑
PfAgo结合并引导其特异性切割荧光探针，PfAgo的切割是基于严格的碱基互补配对，基于此设计双靶点检测平台。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：当体系中存在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
时，经过LAMP扩增能够得到nuc扩增子和mecA扩增子，PfAgo在相应的引导DNA的引导下分别切割nuc扩增子和mecA扩增子，得到次级ssDNAA和ssDNAB，作为新的引导DNA分别引导PfAgo切割荧光探针A和荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：马龙，满淑丽，寇君，李雅茹，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：