基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测试剂盒，包括适用于犀牛快速核酸检测的CRISPR荧光检测体系，所述CRISPR荧光检测体系包括：针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA；高效等温扩增引物组合；CRISPR

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测方法及检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种对犀牛核酸的快速检测方法及试剂盒，更具体地说，是关于一种基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测方法及检测试剂盒。

技术介绍

[0002]历史上曾经有二十多种犀牛广泛分布于世界各地。但目前，印度犀牛(Rhinocero sunicornis)，爪哇犀牛(Rhinocero ssondaicus)，苏门答腊犀牛(Didermoce russumatrensis)，非洲黑犀牛(Diceros bicornis)和非洲白犀牛(Ceratotherium simum)是目前仅存的5种犀牛，并且均处于濒危状态。
[0003][0004][0005]如何利用技术手段对犀牛源性制品进行快速准确的鉴定是业界面临的一个重大挑战。因此迫切需要建立精确、快速、高灵敏的犀牛特异性检测技术体系对犀牛角及其产品进行物种鉴定。
[0007]目前，对于犀牛角物种的鉴定技术主要依赖于传统形态学鉴定技术、蛋白质电泳法、实时荧光定量检测技术、以及基于扩增子测序和DNA条形码检测技术。其中，形态学鉴定技术依赖于专业人士的长期研究积累，可以快速对物种进行区分，但是其鉴定严重依赖于完整的特征性形态，而对于相关制品，特别是加工过的样本，例如交粉、丸剂药物、加工产品等不具备形态学特征的样本则无法完成鉴定。蛋白质相关分析方法对于经过加热导致蛋白变性的样本也无法完成检测鉴定。而基于DNA的分子生物学方法则体现出了明显的检测优势。但荧光定量PCR技术和基于扩增子测序和DNA条形码的检测技术均严重依赖高级别分子生物学实验室和较为大型的仪器设备，且检测成本较高，检测周期也比较长，无法满足现场快速检测的实际场景需求。
[0008]CRISPR
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Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统(Barrangou,R.,et al.,CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.Science,2007,315(5819):p.1709
‑
12)，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR
‑
Cas12a(Cas12a)属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域(Marraffini,L.A.and E.J.Sontheimer,CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.Science,2008.322(5909):p.1843
‑
5)。Cas12a酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine,T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)。当CRISPR
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Cas12a蛋白以序列特异性方式识别切割靶双链DNA时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。

技术实现思路

[0009]针对目前对于犀牛物种特异性现场快速检测鉴定所存在的缺点和不足，本专利技术基于CRISPR
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Cas12a酶的上述特性，开发了一种快速准确的检测方法，用于对犀牛特异性靶序列进行检测。首先，对样品进行核酸释放和富集，并在等温条件下同时进行重组酶聚合酶扩增(ERA)(Liu,S.,et al.,CRISPR/Cas12a Technology Combined with RT
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ERA for Rapid and Portable SARS
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CoV
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2Detection.Virol Sin,2021.36(5):p.1083
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1087)和Cas12a
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crRNA复合物结合并切割靶标dsDNA，其激活ssDNA的反式切割，与ssDNA偶联的荧光报告分子在切割时产生荧光信号。这种称为DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告基因的新方法，为快速准确检测犀牛特异性核酸提供了强有力的平台。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]本专利技术的第一个方面，提供了一种基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测试剂盒，所述检测试剂盒包括适用于犀牛快速核酸检测的CRISPR荧光检测体系，所述CRISPR荧光检测体系包括：
[0012]针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA；
[0013]高效等温扩增引物组合；
[0014]CRISPR
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Cas12a蛋白；以及
[0015]单链DNA报告系统。
[0016]根据本专利技术的优选实施例，所述针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0017]根据本专利技术的优选实施例，所述高效等温扩增引物组合为引物Rhino
‑
ERA
‑
F1、Rhino
‑
ERA
‑
F2、Rhino
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ERA
‑
R1与Rhino
‑
ERA
‑
R2的组合，其序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
[0018]根据本专利技术，所述单链DNA报告系统是被6
‑
羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记的产物为/5
′
6FAM/TTTATTT/3
′
BHQ1/。
[0019]本专利技术的第二个方面，提供了一种基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测方法，采用如上所述的检测试剂盒进行检测。
[0020]进一步的，所述犀牛核酸快速检测方法包括以下步骤：
[0021]S1：取待测样品，利用快速核酸释放剂释放样品中的核酸；
[0022]S2：将S1获得的核酸、以及高效等温扩增引物组合，加入到高效等温扩增体系中进行扩增，获得特异性产物；
[0023]S3：将S2获得的特异性产物加入CRISPR检测体系中，对特异性产物进行识别切割；
[0024]S4；利用荧光酶标仪检测或荧光灯肉眼直接检测判读待测样品中是否存在犀牛特异性核酸。
[0025]本专利技术的第三个方面，提供了一种针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA，其序列如SEQ ID NO.3所示。
[0026]本专利技术的第四个方面，提供了一种适用于犀牛快速核酸检测的CRISPR荧光检测体系，包括本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括适用于犀牛快速核酸检测的CRISPR荧光检测体系，所述CRISPR荧光检测体系包括：针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA；高效等温扩增引物组合；CRISPR
‑
Cas12a蛋白；以及单链DNA报告系统。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述针对犀牛线粒体基因上靶序列的特异性crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述高效等温扩增引物组合为引物Rhino
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ERA
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F1、Rhino
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ERA
‑
F2、Rhino
‑
ERA
‑
R1与Rhino
‑
ERA
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R2的组合，其序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述单链DNA报告系统是被6
‑
羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记的产物为/5
′
6FAM/TTTATTT/3
′
BHQ1/。5.一种基于CRISPR荧光法的犀牛核酸快速检测方法，其特征在于，采用权利要求1～4中任一项所述的检测试剂盒进行检测。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于包括以下步骤：S1：取待测样品，利用快速核酸释放剂释放样品中的核酸；S2：将S1获得的核酸、以及高效等温扩增引物组合，加入到高效等...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑛，蔡一村，张冲，陈立军，张梦琪，林颖峥，冯之航，薛俊欣，王艳，熊炜，张强，赵简，潘良文，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：