mEOS纳米抗体及其制备方法和应用技术

mEOS纳米抗体及其制备方法和应用，涉及生物工程技术领域，本发明专利技术通过构建mcherry或mEOS纳米抗体文库，筛选出了特异的阳性单克隆纳米抗体，并检测出了能够与mcherry蛋白结合的两种mcherry纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示，以及能够与mEOS蛋白结合的七种mEOS纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17所示。本发明专利技术构建的mcherry或mEOS纳米抗体，相对传统抗体而言可提高产量、降低成本，并获得更好的稳定性。获得更好的稳定性。获得更好的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
mEOS纳米抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其指一种mEOS纳米抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]mcherry是一种被广泛用于生物技术作为示踪剂的单体红色荧光蛋白分子，包括分子的标记和细胞组分的定位等。因为其颜色和单体分子的光稳定性，在生物医学研究领域，将其用作蛋白质标签比其它荧光蛋白标签更优异。
[0003]mEOS是一种光激活的绿色到红色的荧光蛋白分子。mEOS可发出强烈的绿色荧光，在390 nm的紫外线照射下不可逆地转变为红色。在生物医学研究领域通常用作蛋白质标签，用于蛋白的多色标记，对蛋白质进行定位标记，追踪活细胞内蛋白质运动。
[0004]传统的mcherry抗体和mEOS抗体均是通过免疫动物所获得，成本高而产量低，并且批次之间稳定性较差，传统抗体结构为两条重链、两条轻链组成的四聚体，其酸碱稳定性差，易变性。
[0005]纳米抗体是克隆重链抗体的可变区得到的只由一个重链可变区组成的单域抗体，重链抗体（HCAb）存在于骆驼等驼类血清中，天然的缺失轻链及常规抗体重链恒定区 CH1，于1993 年被Hamers 等首次报道，纳米抗体晶体结构直径 2.5 nm、长 4 nm，分子量非常小。与常规抗体相比，纳米抗体有诸多优点，制备纳米抗体将会是解决传统抗体缺点过多的有效手段之一。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种mEOS纳米抗体，以提高产量、降低成本，并获得相较于传统抗体更好的稳定性。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：mcherry或mEOS纳米抗体，所述mcherry纳米抗体包括两种编码基因，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3所示；所述mEOS纳米抗体包括七种编码基因，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17所示。
[0008]另外，本专利技术还提供两种mcherry纳米抗体，其氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4所示。
[0009]以及还提供七种mEOS纳米抗体，其氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、 SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18所示。
[0010]同时还提供mcherry纳米抗体的表达载体，其表达载体包括两种mcherry纳米抗体的表达载体，其分别含有上述的两种mcherry纳米抗体的编码基因；以及还提供mEOS纳米抗体的表达载体，其表达载体包括七种mEOS纳米抗体的表达载体，其分别含有上述的七种mEOS纳米抗体的编码基因。
[0011]进一步，所述表达载体为大肠杆菌质粒表达载体或pADL
‑
10b。
[0012]与上述的mcherry纳米抗体或mEOS纳米抗体相关的生物材料，该生物材料为（a1）至（a8）中的任一种：（a1）编码上述的mcherry纳米抗体或mEOS纳米抗体的核酸分子；（a2）含有（a1）所述核酸分子的表达盒。
[0013]（a3）含有（a1）所述核酸分子的重组载体。
[0014]（a4）含有（a2）所述表达盒的重组载体。
[0015]（a5）含有（a1）所述核酸分子的转基因动物细胞系。
[0016]（a6）含有（a2）所述表达盒的转基因动物细胞系。
[0017]（a7）含有（a3）所述重组载体的转基因动物细胞系。
[0018]（a8）含有（a4）所述重组载体的转基因动物细胞系。
[0019]除此之外，还提供一种衍生抗体，所述衍生抗体为下述A）或B）或C）或D）或E）：A）含有上述纳米抗体的单链抗体；B）含有A）所述单链抗体的融合抗体；C）含有上述纳米抗体的融合抗体；D）含有上述纳米抗体的Fab；E）含有上述纳米抗体的完整抗体。
[0020]本专利技术还提供一种mcherry纳米抗体或mEOS纳米抗体的制备方法，其包括以下步骤：构建mcherry纳米抗体文库或mEOS纳米抗体文库然后进行筛选，富集能结合抗原的抗体文库，再通过ELISA测定方法继续从能结合抗原的抗体文库中筛选出特异的阳性单克隆纳米抗体，最后通过Native binding检测出能够与mcherry蛋白结合的mcherry纳米抗体或能够与mEOS蛋白结合的mEOS纳米抗体。
[0021]优选地，从大肠杆菌表达的mcherry蛋白或mEOS蛋白克隆获得mcherry纳米抗体文库或mEOS纳米抗体文库。
[0022]更优选地，从大肠杆菌表达的mcherry蛋白或mEOS蛋白克隆获得mcherry纳米抗体文库或mEOS纳米抗体文库时，用PCR进行第一轮扩增的引物为：上游引物为： GGTGGTCCTGGCTGC；下游引物为： GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC。
[0023]更优选地，以所述第一轮扩增的引物为模板进行第二轮PCR扩增得到的引物为：上游引物：CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGG；下游引物：GTGTTGGCCTCCCGGGCCGCGTGCGCCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCC更优选地，在构建好的mcherry纳米抗体文库或mEOS纳米抗体文库中挑取单克隆用PCR检测VHH序列插入率，得到的引物为：CACAGGAAACAGCTATGACCATGATTA/GCGTAACGATCTAAAGTTTTGTCG。
[0024]更优选地，通过噬菌体展示技术进行筛选富集能结合抗原的抗体文库。
[0025]更优选地，筛选出特异的阳性单克隆纳米抗体后，用PCR扩增再用Hinf1酶切，挑取序列不重复的克隆以进行后续步骤的实验。
[0026]除此之外，本专利技术还提供了一种应用，该应用为上述的mcherry纳米抗体或mEOS纳米抗体在制备蛋白质标签中的应用。
[0027]本专利技术提供的mcherry纳米抗体或mEOS纳米抗体相较于传统的mcherry抗体和mEOS抗体而言，分子量更小、穿透力更强、特异性更高、亲和力更强，结构更简单并且稳定性也更好，易于重组和表达，可通过细菌或酵母大量发酵生产，产量高且成本低，将其应用于疾病的诊断和治疗中具有明显的优势。
附图说明
[0028]图1为实施例中的mcherry纳米抗体文库构建时的第一轮PCR扩增结果示意图；图2为实施例中mcherry纳米抗体文库构建时的第二轮PCR扩增结果示意图；图3为实施例中ELISA筛选特异的阳性单克隆时包被mcherry酶标板显色的示意图；图4为实施例中ELISA筛选特异的阳性单克隆时包被BSA酶标板显色的示意图；图5为实施例中非变性蛋白凝胶电泳中各单克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.mEOS纳米抗体的编码基因，其特征在于：所述mEOS纳米抗体包括七种编码基因，其核苷酸序列分别如序列表SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17所示。2.mEOS纳米抗体，其特征在于：包括七种mEOS纳米抗体，其氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、 SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18所示。3.mEOS纳米抗体的表达载体，其特征在于：所述表达载体包括七种mEOS纳米抗体的表达载体，其分别含有权利要求1所述的七种mEOS纳米抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：容益康，吴靖，李凯丽，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：