小鼠肝窦内皮细胞的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，该方法利用氯化钆注射清除枯否细胞，结合两步灌流、差速离心、percoll离心、差速贴壁的来实现敢斗内皮细胞的分离。小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，简单易行、细胞纯度高、获得率高，并在体外培养保留完整的结构和功能活性，可用于生化及免疫学。此外，本发明专利技术方法使用实验室常规仪器，成本低可在大部分实验室推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞的提取方法，具体地指一种小鼠肝窦内皮细胞的提取方法。
技术介绍
肝窦内皮细胞(LiverSinusoidalEndothelialCells）属于肝脏中的非实质性细胞，在肝脏中起到屏障、物质代谢、超滤内吞，抗原呈递等作用。近年来国内外学者对肝窦内皮细胞分离方法进行了大量的研究，但要获得纯度高，细胞活性好，功能稳定的肝窦内皮细胞仍很困难，尤其是小鼠肝窦内皮细胞。由于小鼠品系丰富,可以更充分的满足各类研究的需要，所以获得细胞活性好的小鼠肝窦内皮细胞具有重要意义。目前，小鼠肝窦内皮细胞采用以下三种提取方法：两步原位灌流结合密度梯度离心法、机械分离结合酶消化及密度离心法、免疫磁珠分选及流式分选法。两步原位灌流结合密度梯度离心法主要集中于大鼠，由于技术条件的限制，较少应用于小鼠的肝窦内皮细胞分离，且该方法无法将肝窦内皮细胞和枯否细胞(kupffercells)分离，导致最终获得的细胞纯度受到影响；机械分离结合酶消化及密度离心法对细胞损伤过大，而且会造成组织块表面消化过度，内部消化不足；免疫磁珠分选及流式分选法所得到的小鼠肝窦内皮细胞虽然纯度高，但是由于肝窦内皮细胞缺乏特异性的表面标志物，使得细胞获得量少，且细胞分选前必须加上某些化学标记有可能造成细胞的分化或凋亡，同时其昂贵的仪器及试剂费用限制了其在各个实验室的应用。综上所述，现有的三种小鼠肝窦内皮细胞提取方法均有各自的缺陷，现有技术尚未报道有合适的针对小鼠的肝窦内皮细胞提取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于弥补现有技术针对小鼠肝窦内皮细胞分离时易产生机械损伤，化学预处理导致的细胞活力差，状态下降及纯度不够等缺陷，提供一种能够较好的保持细胞完整性和生化活性，且一次提取的肝窦内皮细胞数量较多，纯度高小鼠肝窦内皮细胞的提取方法。为实现上述目的，本专利技术所设计的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，包括以下步骤：1选取小鼠尾静脉注射氯化钆溶液，氯化钆的日注射量和小鼠体重之比为10~20mg/25g，连续注射两日后进行手术，术前一天禁食。2消毒器械及动物工作台，36~38℃预温D-hanks液，1640培养液及胶原酶IV溶液。3选取小鼠腹腔注射戊巴比妥钠及肝素钠，戊巴比妥钠的日注射量和小鼠体重之比为40~100mg/kg，肝素钠40~60U/只。4待小鼠完全麻醉后固定于动物手术台，消毒小鼠腹部，无菌纱布铺巾防止污染。5取正中切口进腹，撑开腹腔，将肠管拨向左下腹，暴露门静脉及下腔静脉。6连接五十毫升注射器、灌注泵、延长管及静脉留置针，开启灌注泵，让预温的D-hanks液充满延长管及静脉留置针，排净空气。7静脉留置针穿刺门静脉，成功后拔出针芯，双重丝线结扎，D-hanks液被泵入门静脉，观察到肝脏颜色变成土黄色时，剪开下腔静脉，调整灌流速度为30ml/h。8依次剪开肝脏周围韧带及膈肌，将肝脏迅速完整的分离下来，勿损伤肝脏，将其置于预先放置了36~38℃D-hanks液的培养皿中，持续D-hanks液灌注25~40min。9然后，将灌流液体换为预温的胶原酶IV溶液，调整灌流速度为15~17ml/h，灌流20~30min后，拔出静脉留置针，将肝脏置于胶原酶IV溶液中于37℃温箱放置10~20min。10从温箱中取出肝脏，将肝脏置于100目滤网上，减去胆囊及与肝脏相连的膈肌、韧带、肝门区血管，无损伤镊剥离肝包膜，挑去其中脉管系统，用预温的1640培养液反复冲洗将细胞滤过滤网。11过滤后的细胞悬液低速50g离心3min，使肝脏实质性细胞沉淀，取上清液以800g离心10min后，取细胞沉淀以3毫升1640培养液重悬，得细胞悬液备用。12在离心管中，分别铺3ml的50%percoll溶液，3ml的25%percoll溶液，及3ml细胞悬液，常温离心1200g，20~40min。13取两层percoll液体之间的细胞层，用1640培养液重悬混匀后，2000rmp离心10min，去掉上清，所得沉淀用1640培养液重悬并同样条件再离心一次，取沉淀得到待培养细胞，在体积百分比浓度为20%的胎牛血清中培养。14观察待培养细胞的贴壁状态，待细胞贴壁1小时后，取未贴壁细胞悬液于新容器中培养，12小时后换液，去除未贴壁细胞及死亡细胞，即为肝窦内皮细胞。其中，所述胶原酶IV溶液的质量浓度为0.05~0.1%，优选为0.05%。所述氯化钆溶液的浓度为90~120mg/ml，优选为100mg/ml。所述氯化钆溶液的配制方法为：按照每1ml无内毒素0.1M磷酸盐缓冲液或每1ml生理盐水溶解90~120mg氯化钆的比例配制，并过滤除菌。所述步骤1中，氯化钆的日注射量和小鼠体重之比优选为10mg/25g。所述25%percoll溶液和50%percoll溶液的配制方法为：percoll原液高压消毒，然后，9份percoll原液混合1份质量浓度为8.5%的生理盐水，混匀后为100%percoll溶液；取1.5ml的100%percoll溶液混合1.5ml的生理盐水，配制为50%percoll溶液；取0.75ml的100%percoll溶液混合2.25ml的生理盐水，配制为25%percoll溶液。所述质量浓度为0.05~0.1%的胶原酶IV溶液的配制方法为：每200ml的D-hanks液中溶解100~200mg胶原酶IV，4℃搅拌过夜，过滤除菌后，分装保存。本专利技术提供的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法是利用氯化钆注射清除枯否细胞，结合两步灌流、差速离心、percoll离心、差速贴壁的来实现肝窦内皮细胞的分离。和现有技术相比，本专利技术采用小鼠预注射氯化钆溶液两天，以促进KC细胞的凋亡，同时保护肝窦内皮细胞在分离过程中窗孔结构的完整和活性的稳定，从而使提取的细胞纯度明显升高，活性得到保持；选用两步灌注法保证肝窦内血液充分清除，预防了酶消化不完全及机械损伤。本专利技术的有益效果：所提供的小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，简单易行、细胞纯度高、获得率高，并在体外培养保留完整的结构和功能活性，可用于生化及免疫学。此外，本专利技术方法使用实验室常规仪器，成本低可在大部分实验室推广。以下结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细描述。实施例针对小鼠提取肝窦内皮细胞的步骤为：1选取正常雄性KM小鼠，周龄约9~10周，体重20~25g之间，尾静脉注射氯化钆溶液0.1~0.2ml（约10mg~20mg/25g）连续两日后进行手术，术前一天禁食，不限水。2消毒器械及动物工作台，紫外线预照射实验台1小时，37℃预温D-hanks，1640培养液，及质量浓度为0.05%胶原酶IV溶液。3取小鼠一只腹腔注射0.1ml质量浓度为1%（10mg/ml）的戊巴比妥钠溶液，约40mg/kg，及0.2ml浓度为200U/ml的肝素钠溶液，约40U/只。4待小鼠完全麻醉后固定于动物手术台，用质量浓度为75%酒精消毒小鼠腹部三遍，裁剪好无菌纱布铺巾防止污染。5取正中切口进腹，用开睑器撑开腹腔，蚊式止血钳提起剑突固定，充分暴露腹腔，滴加少许生理盐水，防止腹腔干燥；将肠管拨向左下腹，暴露门静脉及下腔静脉。6连接五十毫升注射器、灌注泵、延长管及22号静脉留置针，开启灌注泵，让37℃预温的D-hanks液充满延长管及静脉留置针，调整灌注速度为2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，包括以下步骤：1）选取小鼠尾静脉注射氯化钆溶液，氯化钆的日注射量和小鼠体重之比为10~20mg/25g，连续注射两日后进行手术，术前一天禁食；2）消毒器械及动物工作台，36~38℃预温D‑hanks液，1640培养液及胶原酶IV溶液；3）选取小鼠腹腔注射戊巴比妥钠及肝素钠，戊巴比妥钠的日注射量和小鼠体重之比为40~100mg/kg，肝素钠40~60U/只；4）待小鼠完全麻醉后固定于动物手术台，消毒小鼠腹部，无菌纱布铺巾防止污染；5）取正中切口进腹，撑开腹腔，将肠管拨向左下腹，暴露门静脉及下腔静脉；6）连接五十毫升注射器、灌注泵、延长管及静脉留置针，开启灌注泵，让预温的D‑hanks液充满延长管及静脉留置针，排净空气；7）静脉留置针穿刺门静脉，成功后拔出针芯，双重丝线结扎，D‑hanks液被泵入门静脉，观察到肝脏颜色变成土黄色时，剪开下腔静脉，调整灌流速度为30ml/h；8）依次剪开肝脏周围韧带及膈肌，将肝脏迅速完整的分离下来，勿损伤肝脏，将其置于预先放置了36~38℃D‑hanks液的培养皿中，持续D‑hanks液灌注25~40min；9）然后，将灌流液体换为预温的胶原酶IV溶液，调整灌流速度为15~17ml/h，灌流20~30min后，拔出静脉留置针，将肝脏置于胶原酶IV溶液中于37℃温箱放置10~20min；10）从温箱中取出肝脏，将肝脏置于100目滤网上，减去胆囊及与肝脏相连的膈肌、韧带、肝门区血管，无损伤镊剥离肝包膜，挑去其中脉管系统，用预温的1640培养液反复冲洗将细胞滤过滤网；11）过滤后的细胞悬液低速50g离心3min，使肝脏实质性细胞沉淀，取上清液以800g离心10min后，取细胞沉淀以3毫升1640培养液重悬，得细胞悬液备用；12）在离心管中，分别铺3ml的50%percoll溶液，3ml的25%percoll溶液，及3ml细胞悬液，常温离心1200g，20~40min；13）取两层percoll液体之间的细胞层，用1640培养液重悬混匀后，2000rmp离心10min，去掉上清，所得沉淀用1640培养液重悬并同样条件再离心一次，取沉淀得到待培养细胞，在体积百分比浓度为20%的胎牛血清中培养；14）观察待培养细胞的贴壁状态，待细胞贴壁1小时后，取未贴壁细胞悬液于新容器中培养，12小时后换液，去除未贴壁细胞及死亡细胞，即为肝窦内皮细胞；其中，所述胶原酶IV溶液的质量浓度为0.05~0.1%。...

【技术特征摘要】
1.一种小鼠肝窦内皮细胞的提取方法，包括以下步骤：1）选取小鼠尾静脉注射氯化钆溶液，氯化钆的日注射量和小鼠体重之比为10~20mg/25g，连续注射两日后进行手术，术前一天禁食；2）消毒器械及动物工作台，36~38℃预温D-hanks液，1640培养液及胶原酶IV溶液；3）选取小鼠腹腔注射戊巴比妥钠及肝素钠，戊巴比妥钠的日注射量和小鼠体重之比为40~100mg/kg，肝素钠40~60U/只；4）待小鼠完全麻醉后固定于动物手术台，消毒小鼠腹部，无菌纱布铺巾防止污染；5）取正中切口进腹，撑开腹腔，将肠管拨向左下腹，暴露门静脉及下腔静脉；6）连接五十毫升注射器、灌注泵、延长管及静脉留置针，开启灌注泵，让预温的D-hanks液充满延长管及静脉留置针，排净空气；7）静脉留置针穿刺门静脉，成功后拔出针芯，双重丝线结扎，D-hanks液被泵入门静脉，观察到肝脏颜色变成土黄色时，剪开下腔静脉，调整灌流速度为30ml/h；8）依次剪开肝脏周围韧带及膈肌，将肝脏迅速完整的分离下来，勿损伤肝脏，将其置于预先放置了36~38℃D-hanks液的培养皿中，持续D-hanks液灌注25~40min；9）然后，将灌流液体换为预温的胶原酶IV溶液，调整灌流速度为15~17ml/h，灌流20~30min后，拔出静脉留置针，将肝脏置于胶原酶IV溶液中于37℃温箱放置10~20min；10）从温箱中取出肝脏，将肝脏置于100目滤网上，减去胆囊及与肝脏相连的膈肌、韧带、肝门区血管，无损伤镊剥离肝包膜，挑去其中脉管系统，用预温的1640培养液反复冲洗将细胞滤过滤网；11）过滤后的细胞悬液低速50g离心3min，使肝脏实质性细胞沉淀，取上清液以800g离心10min后，取细胞沉淀以3毫升1640培养液重悬，得细胞悬液备用；12）在离心管中，分别铺3ml的50%percoll溶液，3ml的25%percoll溶液，及3ml细胞悬液，常温离心1200g，20~40min；13）取两层percoll液体之间的细胞层，用1640培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘乃山，宋延超，迟培升，
申请(专利权)人：青岛九龙生物医药集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37