PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的方法技术

本发明专利技术适用于生物医学领域，提供了一种PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：PDX1目的基因引物设计；构建PDX1重组质粒；重组蛋白的诱导表达；PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，尤其涉及一种PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的方法。
技术介绍
糖尿病是一种伴随多种严重并发症的常见病，暂无治愈疗法。胰腺移植是治疗糖尿病的重要途径，但供体来源短缺和免疫排斥问题限制其广泛开展。胰岛β细胞是唯一负责转运、合成和释放胰岛素的细胞，胰岛素是体内唯一降低血糖的激素，对外周血糖水平起重要调节作用。多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcell，iPSCs)一种具有自我复制能力且在一定条件下可以分化成多种靶向功能细胞的干细胞，多潜能干细胞的使用，已经逐渐成为人们寻找胰岛β细胞替代物的新资源。然而，尽管多潜能干细胞能够解决供体细胞数量问题，但是在应用前还需要先将其诱导分化为功能性的胰岛样细胞。如何实现iPSCs定向诱导分化为胰岛样细胞，是获取胰岛样细胞的重要课题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的方法，旨在解决如何通过PDX1目的基因诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的问题。本专利技术是这样实现的，一种PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：PDX1目的基因引物设计：提供PDX1目的基因，设计Tat序列和扩增引物，所述扩增引物包括Pdx-1-S和Pdx-1-A；其中，所述Tat序列为：5’-TTCATATGtacggtcgtaaaaagcgtcgtcagcgtcgtcgtGGATCCATGACGCCTC-3’；Pdx-1-S的序列为：5’-attggatccATGAACGGCGAGGAGCAGTA-3’；Pdx-1-A的序列为：5’-attctcgagTCGTGGTTCCTGCGGcc-3’；构建PDX1重组质粒：以所述PDX1目的基因为模板进行扩增，获得PDX1基因片段；将所述PDX1基因片段和载体分别进行酶切后，进行连接和转化处理，挑选阳性克隆，获得PDX1重组质粒；重组蛋白的诱导表达：将所述PDX1重组质粒进行诱导表达，获得PDX1蛋白；PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞：获取人脐带MSCs，在所述人脐带MSCs中加入所述PDX1蛋白，诱导所述人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞。本专利技术提供的PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的方法，通过设计特异的PDX1目的基因引物，来获得PDX1目的基因，进而通过PDX1重组质粒表达PDX1蛋白，诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞。该方法操作简单，获得的PDX1蛋白能够高效诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞，且转分化效果和成熟度较高。附图说明图1是本专利技术实施例提供的第二次扩增的PCR产物电泳结果图；图2是本专利技术实施例提供的重组质粒的酶切鉴定电泳结果图；图3是本专利技术实施例提供的对获得的重组质粒与模板序列的比较图；图4是本专利技术实施例提供的所述重组蛋白的诱导表达的电泳图；图5是本专利技术实施例提供的诱导后表达的蛋白进行WB验证的结果图；图6是本专利技术实施例提供的对重组质粒表达的PDX1蛋白进行SDS-PAGE分析的结果图；图7是本专利技术实施例提供的人脐带间充质干细胞形态及生长曲线图；图8是本专利技术实施例提供的显微镜下PDX1蛋白进入T273细胞的荧光图；图9是本专利技术实施例提供的PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞团形态图；图10是本专利技术实施例提供的转分化为胰岛样细胞团免疫组化检测结果图。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供了一种PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：S01.PDX1目的基因引物设计：提供PDX1目的基因，设计Tat序列和扩增引物，所述扩增引物包括Pdx-1-S和Pdx-1-A；S02.构建PDX1重组质粒：以所述PDX1目的基因为模板进行扩增，获得PDX1基因片段；将所述PDX1基因片段和载体分别进行酶切后，进行连接和转化处理，挑选阳性克隆，获得PDX1重组质粒；S03.重组蛋白的诱导表达：将所述PDX1重组质粒进行诱导表达，获得PDX1蛋白；S04.PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞：获取人脐带MSCs，在所述人脐带MSCs中加入所述PDX1蛋白，诱导所述人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞。具体的，上述步骤S01中，本专利技术实施例的PDX1目的基因选自GenbankID为NM_002500.1，该基因片段的详细情况为启动子：CMV，宿主细胞：Mammalian，筛选基因：Neomycin(新霉素)；蛋白标签：C-eYFP；蛋白酶位点：N/A；载体：pReceiver-M16。本专利技术实施例中，TAT的氨基酸序列优选为YGRKKRRQRRR，相应的，所述Tat的碱基序列为：5’-TCATATGtacggtcgtaaaaagcgtcgtcagcgtcgtcgtGGATCCATGACGCCTC-3’。所述Tat序列5’端带有一个NdeⅠ的酶切位点(CATATG)，3’端带有一个BamHⅠ酶切位点(GGATCC)，同时带有一小段Ngn3的序列。基于所述PDX1目的基因特别是NM_002500.1的基因序列，本专利技术实施例优选设计如下引物(有广州invitrogen合成)：Pdx-1-S的序列为：5’-attggatccATGAACGGCGAGGAGCAGTA-3’；Pdx-1-A的序列为：5’-attctcgagTCGTGGTTCCTGCGGcc-3’。所述Pdx-1-S的序列中含有BamHⅠ酶切位点(ggatcc)，所述Pdx-1-A的序列中含有XhoⅠ酶切位点(ctcgag)。优选的引物序列，具有合适的碱基长度(849bp)和合适的退火温度(60℃)，可以特异性地提高扩增效率和扩增准确性，从而获得在下述的PCR扩增中高效获得准确的基因片段。上述步骤S02中，作为本专利技术优选实施例，将所述PDX1目的基因作为模板进行扩增、获得PDX1基因片段，包括以下步骤：S021.第一次扩增：以所述PDX1目的基因为模板，以所述Pdx-1-S和Pdx-1-A为引物，进行第一次扩增，所述第一次扩增的扩增体系如下：优选的，所述第一次扩增的反应条件为：95℃，3min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，45s，30个循环；7本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：PDX1目的基因引物设计：提供PDX1目的基因，设计Tat序列和扩增引物，所述扩增引物包括Pdx‑1‑S和Pdx‑1‑A；其中，所述Tat序列为：5’‑TTCATATGtacggtcgtaaaaagcgtcgtcagcgtcgtcgtGGATCCATGACGCCTC‑3’；Pdx‑1‑S的序列为：5’‑attggatccATGAACGGCGAGGAGCAGTA‑3’；Pdx‑1‑A的序列为：5’‑attctcgagTCGTGGTTCCTGCGGcc‑3’；构建PDX1重组质粒：以所述PDX1目的基因为模板进行扩增，获得PDX1基因片段；将所述PDX1基因片段和载体分别进行酶切后，进行连接和转化处理，挑选阳性克隆，获得PDX1重组质粒；重组蛋白的诱导表达：将所述PDX1重组质粒进行诱导表达，获得PDX1蛋白；PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞：获取人脐带MSCs，在所述人脐带MSCs中加入所述PDX1蛋白，诱导所述人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞。

【技术特征摘要】
1.一种PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的方法，包括以下步骤：
PDX1目的基因引物设计：提供PDX1目的基因，设计Tat序列和扩增引物，所述扩增引物
包括Pdx-1-S和Pdx-1-A；其中，
所述Tat序列为：
5’-TTCATATGtacggtcgtaaaaagcgtcgtcagcgtcgtcgtGGATCCATGACGCCTC-3’；
Pdx-1-S的序列为：5’-attggatccATGAACGGCGAGGAGCAGTA-3’；
Pdx-1-A的序列为：5’-attctcgagTCGTGGTTCCTGCGGcc-3’；
构建PDX1重组质粒：以所述PDX1目的基因为模板进行扩增，获得PDX1基因片段；将所述
PDX1基因片段和载体分别进行酶切后，进行连接和转化处理，挑选阳性克隆，获得PDX1重组
质粒；
重组蛋白的诱导表达：将所述PDX1重组质粒进行诱导表达，获得PDX1蛋白；
PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞：获取人脐带MSCs，在所述人脐带MSCs
中加入所述PDX1蛋白，诱导所述人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞。
2.如权利要求1所述的PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的方法，其特征
在于，所述PDX1目的基因的GenbankID为NM_002500.1。
3.如权利要求1所述的PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的方法，其特征
在于，所述以所述PDX1目的基因为模板进行扩增、获得PDX1基因片段的方法，包括以下步
骤：
第一次扩增：以所述PDX1目的基因为模板，以所述Pdx-1-S和Pdx-1-A为引物，进行第一
次扩增，所述第一次扩增的扩增体系如下：
第二次扩增：以所述第一次扩增的PCR产物为模板，以Tat序列和所述Pdx-1-A为引物，
进行第二次扩增，所述第二次扩增的扩增体系如下：
回收PDX1基因片段：将所述第二次扩增的PCR产物，用1％琼脂糖电泳，6-8V/cm下25-
30min，用凝胶回收试剂盒回收PDX1目的片段。
4.如权利要求1-3任一所述的PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的方法，
其特征在于，所述将所述PDX1基因片段进行酶切采用BamHⅠ与XhoⅠ进行双酶切，且酶切体
系为：
5.如权利要求1-3任一所述的PDX1蛋白诱导人脐带MSCs转分化为胰岛样细胞的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周汉新，周雅君，肖亮，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44