CAR‑T细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种CAR‑T细胞及其制备方法与应用，其中，所述CAR‑T细胞的CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区，所述胞膜外抗原结合区为用于结合HER2蛋白的chA21scFv；所述胞内信号传导区为CD28‑X‑ITAM，其中，所述X为ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子。本发明专利技术CAR‑T细胞的chA21scFv能够表达抗HER2单克隆抗体，且以HER2蛋白为靶向直接识别并结合肿瘤细胞表面高表达的HER2蛋白，从而活化T细胞而分泌杀伤表达HER2蛋白的肿瘤细胞的细胞因子。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及T淋巴细胞
，尤其涉及一种CAR-T细胞及其制备方法与应用。
技术介绍
CAR-T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，嵌合抗原受体T细胞)即是表达嵌合抗原受体修饰的T细胞，而CAR-T细胞的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区三部分构成。其中，胞膜外抗原结合区是一段单链可变区结构域(single chain Fv domain，scFv)，具有特异性识别并结合TAA(tumor-associated antigen，肿瘤相关性抗原)的功能。scFv的构成是将单克隆抗体的重链可变区(the variable region of heavy chain，VH)和轻链可变区(the variable region of light chain，VL)用一可弯曲的多肽接头(Linker)将VH和VL连接起来，构成VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。铰链区通常是由免疫球蛋白超家族组成，比如CD8、CD28和IgG。胞内信号传导区包括共刺激分子(costimulatory molecule，CM)和免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)，其中，CM通常为CD28，ITAM通常为CD3ζ或FcεRIγ。表达CAR的T细胞可通过scFv直接识别并结合肿瘤细胞表面的TAA，CAR将信号传入T细胞内，激活T细胞分泌细胞因子包括穿孔素、颗粒酶、INF-γ、TNF-a等，从而发挥杀伤肿瘤细胞作用。因此，CAR-T细胞是MHC非限制性的。CAR-T细胞将抗体-抗原特异性结合能力以及T细胞介导的杀伤功能结合于一体，是免疫抗肿瘤治疗的重要方法。嵌合性抗原受体方法应用的关键是确定一种肿瘤相关性抗原，在肿瘤细胞表面高表达，而在正常组织中无表达或者低表达。原癌基因人上皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，Her-2/neu)又称HER2或c-erbB-2基因，在多种肿瘤的发病及临床进程中发挥重要作用，体外与动物实验己明确显示Her-2/neu基因扩增、蛋白过度表达在致瘤转化和肿瘤发展中起着关键作用。研究证实：30％以上的人类肿瘤组织中，如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、宫颈癌、前列腺癌、胃癌、唾液腺癌、舌癌、头颈部鳞癌、非小细胞性肺癌等，均伴有Her-2/neu基因的扩增及p185蛋白的过度表达，而正常组织中p185蛋白为阴性或微量表达。而在乳腺癌中，大约有1/3的病人过表达HER2蛋白。过表达HER2蛋白使肿瘤的侵袭性更强，是乳腺癌病人预后不良的独立的危险因素。尽管抗HER2单克隆抗体(如曲妥株单抗)在临床的应用使部分病人获益，但是其价格昂贵，很大程度上限制了其大规模临床应用。HER2蛋白位于细胞表面，容易被抗体识别，因此，HER2蛋白可作为CAR-T细胞抗肿瘤治疗的一个理想靶点。然而，现有技术中并未提供表达抗HER2单克隆抗体的CAR-T细胞，即现有的CAR-T细胞并不能以HER2蛋白为靶向而直接识别并结合HER2蛋白，导致CAR无法将信号传入T细胞内，而无法分泌杀伤高表达HER2蛋白的肿瘤细胞的细胞因子。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种CAR-T细胞，旨在表达抗HER2单克隆抗体，而以HER2蛋白为靶向直接识别并结合肿瘤细胞表面高表达的HER2蛋白。为实现上述目的，本专利技术提供一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区，所述胞膜外抗原结合区为用于结合HER2蛋白的chA21scFv；所述胞内信号传导区为CD28-X-ITAM，其中，所述X为ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子。优选地，所述X为ICOS共刺激分子。本专利技术还提供一种CAR-T细胞的制备方法，包括步骤如下：构建CAR表达载体，其中，所述CAR表达载体的CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区，所述胞膜外抗原结合区为用于结合HER2蛋白的chA21scFv，所述胞内信号传导区为CD28-X-ITAM，所述X为ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子；包装所述CAR表达载体，而制得感染混合物；将所述感染混合物感染T细胞，而制得CAR-T细胞。优选地，所述构建CAR表达载体的过程中，包括步骤如下：获取所述chA21scFv的基因片段、所述铰链区的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段；提供引导链，基因融合所述引导链与所述chA21scFv的基因片段，而形成引导链-chA21scFv；基因融合所述铰链区的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段和所述ITAM的基因片段，而形成铰链区-CD28-X-ITAM；基因融合所述引导链-chA21scFv和所述铰链区-CD28-X-ITAM，而形成引导链-chA21scFv-铰链区-CD28-X-ITAM；将所述引导链-chA21scFv-铰链区-CD28-X-ITAM接入载体，而获得CAR表达载体。优选地，所述获取所述chA21scFv的基因片段、所述铰链区的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段的过程中，包括步骤如下：获取并激活PMBCs；提取所述PMBCs的mRNA并反转录为cDNA；分别提供所述铰链区的引物、所述CD28的引物、所述X的引物和所述ITAM的引物，且均以所述PMBCs的cDNA为模板，分别进行PCR扩增，而获得所述铰链区的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段；提供所述chA21scFv的模板DNA和所述chA21scFv的引物，并进行PCR扩增，而获得所述chA21scFv的基因片段。优选地，所述CAR表达载体为CAR表达病毒质粒。优选地，所述包装所述CAR表达载体的过程中，包括步骤如下：将12～20μg的包装质粒与12～20μg的所述CAR表达病毒质粒通过培养基共混，而获得质粒混合物；将所述质粒混合物与35～45μl的脂质体通过培养基共混，而获得混合液；将所述混合液转染真核细胞，而获得所述真核细胞的上清液；浓缩所述上清液，而制得感染混合物。优选地，所述将所述感染混合物感染T细胞的过程中，包括步骤如下：将0.8～2ml的感染混合物加入(6～10)×105个T细胞中而进行感染；将凝聚胺加入所述T细胞中，使所述凝聚胺的终浓度为10～20μg/ml；培养扩增感染后的T细胞，而获得CAR-T细胞。优选地，所述X为ICOS共刺激分子。本专利技术还提供一种如上所述的CAR-T细胞在治疗乳腺癌的药物上的应用。本专利技术技术方案，通过表达chA21scFv而识别和结合肿瘤细胞表面高表达的HER2蛋白，并通过胞内信号传导区将信号传入T细胞，从而活化T细胞，促进T细胞分泌细胞因子，该细胞因子进而可以杀伤高表达HER2蛋白的肿瘤细胞。而且，胞内信号传导区整合了CD28共刺激分子以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CAR‑T细胞，所述CAR‑T细胞的CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区，其特征在于，所述胞膜外抗原结合区为用于结合HER2蛋白的chA21 scFv；所述胞内信号传导区为CD28‑X‑ITAM，其中，所述X为ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子。

【技术特征摘要】
1.一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞的CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区，其特征在于，所述胞膜外抗原结合区为用于结合HER2蛋白的chA21 scFv；所述胞内信号传导区为CD28-X-ITAM，其中，所述X为ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述X为ICOS共刺激分子。3.一种CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：构建CAR表达载体，其中，所述CAR表达载体的CAR包括胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区，所述胞膜外抗原结合区为用于结合HER2蛋白的chA21 scFv，所述胞内信号传导区为CD28-X-ITAM，所述X为ICOS、CD137、CD134、CD80或者CD86共刺激分子；包装所述CAR表达载体，而制得感染混合物；将所述感染混合物感染T细胞，而制得CAR-T细胞。4.如权利要求3所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述构建CAR表达载体的过程中，包括步骤如下：获取所述chA21 scFv的基因片段、所述铰链区的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段以及所述ITAM的基因片段；提供引导链，基因融合所述引导链与所述chA21 scFv的基因片段，而形成引导链-chA21 scFv；基因融合所述铰链区的基因片段、所述CD28的基因片段、所述X的基因片段和所述ITAM的基因片段，而形成铰链区-CD28-X-ITAM；基因融合所述引导链-chA21 scFv和所述铰链区-CD28-X-ITAM，而形成引导链-chA21 scFv-铰链区-CD28-X-ITAM；将所述引导链-chA21 scFv-铰链区-CD28-X-ITAM接入载体，而获得CAR表达载体。5.如权利要求4所述的CAR-T...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，张翼，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44