一种临床用间充质干细胞的制备方法技术

本发明专利技术提供一种临床用间充质干细胞的制备方法，本发明专利技术制备方法在脐带采集前对产妇进行筛选，以符合条件的健康足月产妇志愿者作为采集目标，之后进行分离扩增进行规模化培养直至第三代，进行冷冻保存，对分离过程及冷冻过程的的中间品进行一系列质量检测，冷冻后细胞复苏洗涤待用，活率无明显降低。本发明专利技术拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行临床级、统一、系统监控，以实现间充质干细胞的临床标准产品。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种临床用间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：步骤一、脐带筛选与保存：筛选、采集健康足月产妇志愿者脐带，置于脐带保存液中4℃冷藏，并于24小时内进行分离处理；步骤二、脐带分离：将脐带转移到培养皿中，生理盐水清洗；去除两端结扎部位，剥除脐静脉和两条脐动脉；展平，撕下华通氏胶，去除羊膜；将撕下的华通氏胶置于离心管中剪碎至1～4mm3小块；步骤三、间充质细胞原代培养：将剪碎的华通氏胶转至装有完全培养基的透气盖培养瓶中，在37℃、5％CO2、饱和湿度环境中培养；细胞密度达约1g/T75瓶，第5天首次换液，此后每3天换液一次，至第14天左右；细胞融合度达80％以上时，用胰蛋白酶消化传代，用原培养上清终止；步骤四、传代培养：传代时，传代细胞接种密度约为6000个/cm2；3天后，细胞密度达80％以上，再次传代；传至第三代，细胞数约为3～5×109，收集细胞并计数和活率，按2×107/ml/管进行冷冻保存；将细胞上清进行无菌检测、支原体检测，取1×107细胞做细胞表面标志检测；步骤五、间充质干细胞表面标志、分化检测：按照ISCT间充质干细胞标准检测阳性指标以及阴性指标；对第三代细胞进行分化实验检测干细胞分化能力，分别向成脂、成骨、成软骨三个方向分化，进行油红O染色、茜素红染色和阿尔新蓝染色鉴定；间充质干细胞表面标志、分化检测后，冷冻保存；步骤六、临床用间干细胞使用：取冷冻细胞，复苏后用生理盐水洗涤两遍，统计细胞数和细胞活率，根据计数结果按临床需要将细胞和复方电解质溶液混匀待用；并留样进行内毒素和细菌检测。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董成友，朱兵锐，江晔，谢天，
申请(专利权)人：上海华颜干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31