一种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途，本发明专利技术所提供的方法包括：利用7天或2个月小鼠，分离睾丸，去除被膜和血管，暴露生精小管后用胶原酶IV消化，过滤消化后的细胞悬液；通过CD51的细胞特异标记，利用流式细胞仪进行分选，获得单个细胞，收集表达CD51的细胞，从而分离出所述CD51阳性睾丸间质干细胞。本发明专利技术提供了根据上述方法分离的睾丸间质来源干细胞，以及进一步在培养基中培养获得的自我更新和增殖、具有多向分化潜能的细胞，并且提供了将这些细胞用于制备治疗睾酮水平低下导致的相关疾病的组合物的用途。

【技术实现步骤摘要】
一种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途
本专利技术涉及干细胞与组织工程
，尤其涉及一种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途。
技术介绍
随着全球老龄化进展加速，各种衰老相关性疾病日益引起人们的重视。其中由于原发性或继发性睾丸间质细胞功能障碍引起的迟发性性腺功能减退(LOH)、老年雄激素缺乏症等疾病在50岁以上男性的发病率高达20％以上，它不仅影响生活质量，也易导致心血管疾病、精神疾病等重大疾病的发生。睾酮补充治疗是目前主要治疗手段。据估计，1997年美国的睾酮产品市场规模约为0.49亿美元，而在2002年就超过3亿美元。统计数字表明，45岁以上的男性有20％受到低睾酮水平的困扰，而接受治疗的仅2％，表明存在巨大的市场潜力。但是外源性睾酮制剂无法模拟机体睾酮的生理情况，长期给予会导致睾丸局部睾酮浓度下降，最终引起精液质量下降并进而影响男性生育功能，因此，睾酮制剂治疗LOH治疗始终有很多争议。睾丸间质细胞移植是治疗迟发性性腺功能减退症等疾病的最佳手段。邓春华研究团队成功体外培养出睾丸间质细胞后，对血清睾酮和游离睾酮水平均明显下降的老年SD大鼠进行了睾丸间质细胞移植，在没有应用免疫抑制剂的情况下，移植后老年SD大鼠的血清睾酮和游离睾酮均显著升高至成年SD大鼠的水平，提示同种异体睾丸间质细胞移植是一种新的、有效的、更符合生理的补充睾酮的方法。但睾丸间质细胞的来源有限，扩增能力有限，大大限制了其进一步的应用。睾丸间质干细胞是具有自我更新、可分化为睾丸间质细胞的一类细胞。在大鼠出生后7天，梭形的睾丸间质干细胞主要分布在大鼠睾丸间质细胞部分以及血管周围。Davidoff等认为睾丸的血管即血管平滑肌细胞及周细胞是睾丸间质细胞的前体细胞(DavidoffMS,MiddendorffR,EnikolopovG,RiethmacherD,HolsteinAF,MullerD.Progenitorcellsofthetestosterone-producingLeydigcellsrevealed.TheJournalofcellbiology2004；167:935-944.)。目前对睾丸间质干细胞的研究甚少，没有明确的特意标志物。而对于睾丸间质干细胞的纯化方法也仅仅局限于Metrizamide或Percoll密度梯度离心法，结合PDGFR-α阳性且LHR阴性细胞的免疫选择(Immunoselection)法，纯化出大鼠睾丸中的睾丸间质干细胞。葛仁山等人取60只7天龄大鼠睾丸进行睾丸间质干细胞分离，最终获得每一个睾丸中8，500睾丸间质干细胞，将分离得到的睾丸间质干细胞移植入睾丸间质细胞损伤大鼠模型中(用全称，二甲磺酸乙烷，EDS)，发现睾丸间质干细胞可以在体内定植，并分化成有功能的睾丸间质细胞(GeRS,DongQ,SottasCM,PapadopoulosV,ZirkinBR,HardyMP.InsearchofratstemLeydigcells:identification,isolation,andlineage-specificdevelopment.ProcNatlAcadSciUSA.2006；103:2719-2724)。虽然，移植睾丸间质干细胞治疗LOH为临床提供了良好的应用前景，但是现行方法存在获得细胞量少，细胞种类不明确，缺乏细胞鉴定标准等众多弊端，明显制约了临床应用，需要进一步的深入研究。CD51又称为整合素蛋白αv，是整合素蛋白超家族中的一员，其实质为异质二聚体整合膜蛋白由α链和β链两部分构成。进一步可细分为αvβ1，αvβ3，αvβ5，αvβ6和αvβ8共5个亚型。在调控胚胎器官形成，血管生成，血管通透性，癌症演进，上皮组织的炎症及纤维化中发挥重要作用要作用。有研究报道，CD51广泛分布于牙周韧带，人脐带血及华通氏胶中MSC样细胞的表面。同时，也发现CD51存在于大部分人骨髓MSC细胞的表面，认为是MSC的标志物(PinhoS,LacombeJ,HanounMetal.PDGFRalphaandCD51markhumannestin+sphere-formingmesenchymalstemcellscapableofhematopoieticprogenitorcellexpansion.TheJournalofexperimentalmedicine2013；210:1351-1367)。目前尚未见研究报道以CD51为标记物分离和鉴定睾丸间质干细胞的相关研究。
技术实现思路
本专利技术的目的在于简化睾丸间质干细胞的分离及培养方法，提供睾丸间质干细胞的鉴定方法，以及其应用。本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的睾丸间质干细胞的分离方法是选择7天或2个月龄小鼠，分离小鼠睾丸，用胶原酶IV消化睾丸组织，过滤消化后的细胞悬液，滤过筛网，获得单个细胞，所述细胞用CD51抗体进行标记；以IgG标记的对照样本细胞为阴性对照细胞，将用CD51抗体进行标记的单个细胞通过流式细胞仪进行分选，收集CD51荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出CD51阳性的睾丸间质干细胞。本专利技术的分离方法的具体步骤如下：(1)利用生后7天或两月龄雄性小鼠，采用颈椎脱臼法处死，在无菌条件下打开阴囊部，取出双侧睾丸并在解剖显微镜下去除被膜和血管，用含1％双抗的1×PBS反复冲洗，随后用吸管及枪头轻轻吹打，使间质组织与曲精细管分散开，并用小剪刀剪碎组织部分，随后放入1mg/ml的IV型胶原酶溶液，于37℃、5％CO2条件下孵育15min，加入含0.5％BSA的1×PBS终止胶原酶的消化，1500rmp离心5min；弃去上清液，用孔径为40μm的尼龙网过滤悬液，去除未消化的曲细精管，收集单细胞，以1500rmp离心5min，得到睾丸细胞悬液；(2)进行CD51抗体标记，CD51抗体与睾丸细胞悬液混合，两者体积比为1:100，4℃微旋孵育30分钟，对照细胞样本与IgG进行孵育，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次，经流式分选收集表达CD51的抗体荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述CD51阳性睾丸间质干细胞。本专利技术的分离方法得到的睾丸间质干细胞的培养方法如下：将分离得到的睾丸间质干细胞在培养基中进行培养，产生自我更新和增殖的细胞；经实验表明，单纯在DMEM/F12基础培养基，或加10％血清的培养基中培养分离的CD51阳性睾丸间质干细胞不增殖，容易分化。因此，本专利技术在DMEM/F12基础培养基的基础上进行改良，优选的培养基为无血清培养基，其成分为：DMEM-F12培养基中加入1nM地塞米松、1ng/mlLIF(白血病抑制因子),5mg/literinsulin(胰岛素),5mg/litertransferrin(转铁蛋白),5ug/litersodiumselenite(亚硒酸钠)的ITS(insulin-transferrin-sodiumselenite)、5％鸡胚提取物、0.1mMβ-巯基乙醇、1％非必需氨基酸、1％N2(N2添加剂)、2％B27(B27无血清添加剂)、20ng/mlbFGF(基础成纤维细胞生长因子)、20ng/mlEGF(表皮细胞生长因子)、20ng/mlPD本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种睾丸间质干细胞的分离方法，其特征在于：所述的分离方法是选择7天或2个月龄小鼠，分离小鼠睾丸，用胶原酶IV，过滤消化后的细胞悬液，滤过筛网，获得单个细胞，所述细胞用CD51抗体进行标记；将上述已经标记的单个细胞通过流式细胞仪进行分选，收集CD51荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出所述CD51阳性的睾丸间质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种睾丸间质干细胞的分离方法，其特征在于：所述的分离方法是选择7天或2个月龄小鼠，分离小鼠睾丸，用胶原酶IV消化睾丸组织，过滤消化后的细胞悬液，滤过筛网，获得单个细胞，所述细胞用CD51抗体进行标记；以IgG标记的对照样本细胞为阴性对照细胞，将用CD51抗体进行标记的单个细胞通过流式细胞仪进行分选，收集CD51荧光强度是阴性对照细胞的荧光强度的10倍或以上的细胞，从而分离出CD51阳性的睾丸间质干细胞。2.如权利要求1所述的睾丸间质干细胞的分离方法，其特征在于：所述的分离方法的具体步骤如下：(1)利用生后7天或两月龄雄性小鼠，采用颈椎脱臼法处死，在无菌条件下打开阴囊部，取出双侧睾丸并在解剖显微镜下去除被膜和血管，用含1％双抗的1×PBS反复冲洗，...

【专利技术属性】
技术研发人员：项鹏，姜美花，蔡炳，臧志军，汪建成，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44