一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种牛睾丸细胞系。本发明专利技术还提供了该细胞系的建立方法，主要步骤为：(1)原代培养：无菌获取初生犊牛睾丸，清除粘附组织，采用胰酶消化法分离获得高活力的牛睾丸细胞；将分离得到的高活力的牛睾丸细胞培养于DMEM培养基中，置于37℃，5％CO2条件下培养，得原代牛睾丸细胞；(2)转染和筛选：提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法，将提取纯化的的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)原代培养的牛睾丸细胞进行转染；(3)筛选和扩大培养。本发明专利技术牛睾丸细胞易于培养，生长速度较快，能稳定传代，细胞活率高、纯度高且能很好保藏；本发明专利技术方法操作简便，便于推广应用。本细胞系可应用于生产猪瘟疫苗、羊痘、羊口疮疫苗等。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种牛睾丸细胞系。本专利技术还提供了该细胞系的建立方法，主要步骤为：(1)原代培养：无菌获取初生犊牛睾丸，清除粘附组织，采用胰酶消化法分离获得高活力的牛睾丸细胞；将分离得到的高活力的牛睾丸细胞培养于DMEM培养基中，置于37℃，5％CO2条件下培养，得原代牛睾丸细胞；(2)转染和筛选：提取纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，采用脂质体转染法，将提取纯化的的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)原代培养的牛睾丸细胞进行转染；(3)筛选和扩大培养。本专利技术牛睾丸细胞易于培养，生长速度较快，能稳定传代，细胞活率高、纯度高且能很好保藏；本专利技术方法操作简便，便于推广应用。本细胞系可应用于生产猪瘟疫苗、羊痘、羊口疮疫苗等。【专利说明】一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用
本专利技术属于动物细胞工程
，涉及一种新的细胞系，具体涉及一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用。
技术介绍
疫苗是防治猪瘟主要的预防措施。用异源动物细胞生产疫苗可防止种毒毒力返强及避免使用同源动物造成其他疾病传播，如牛睾丸、羊睾丸、羊肾等原代细胞增殖CSFV C株疫苗。猪瘟病毒(CSFV)能在牛睾丸细胞中增殖，却不使细胞产生病变(CPE)，而且病毒的增殖能够增加原代牛睾丸细胞的传代次数和维待时间。然而长期以来，我国的猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞苗在生产中存在着许多问题:在猪瘟犊牛睾丸细胞苗生产过程中，因多利用奶牛场淘汰的新生犊牛睾丸为生产原料，受供体数量的限制而影响每批产量，如果只应用当天收集的犊牛睾丸，往往因为数量少而不便生产安排。为满足生产需求，生产中通常采用恒温保存，而常常由于冰箱的制冷机制造成的短时间温度过低(不恒温)影响睾丸细胞培养和疫苗的生产。随着养猪业的快速发展，猪瘟牛睾丸细胞苗需求量愈来愈大,单纯依靠犊牛睾丸细胞原代的培养难以满足生产的需要，所以建立牛睾丸细胞系迫在眉睫。同时，原代牛睾丸细胞需要采集犊牛睾丸组织来分离，其来源受到很大限制。因此，现在急需对其方法进行改进，使牛睾丸细胞能够稳定传代下去，达到高细胞活率、高纯度的标准且能得到很好的保藏并延续下去。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高活性、高纯度的牛睾丸细胞系。本专利技术建立了一种牛睾丸细胞系，达到了上述专利技术目的。所述细胞系的保藏号为:CCTCC C201399。上述牛睾丸细胞系可用于生产猪瘟疫苗、羊痘疫苗和羊口疮疫苗，还可在研究病毒在猪瘟病毒、羊痘病毒、羊口疮病毒在睾丸细胞中增殖中应用；还可在分离鉴定羊痘病毒以及研制羊痘病毒疫苗中应用；还可在外源基因转染、细胞凋亡及细胞融合研究中应用。本专利技术的还提供上述细胞系的建立方法，该方法通过采集初生犊牛睾丸进行原代培养；然后向原代细胞导入编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pC1-neo-hTERT进行转染，后筛选含该目的基因的阳性细胞；接着进行筛选和扩大培养，以获得永生化的牛睾丸细胞系，最后对该细胞进行冻存并保臧。上述的牛睾丸细胞系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤:(I)原代培养:采集初生犊牛睾丸，剪成0.5~2.0mm3的组织块，分离得高活力的牛睾丸细胞，培养，得原代牛睾丸细胞，(2)转染和筛选:提取、纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pC1-neo-hTERT，将提取、纯化的的真核表达质粒PC1-neo-hTERT导入步骤(1)所得原代牛睾丸细胞进行转染；(3)筛选和扩大培养:细胞转染真核表达质粒pC1-neo-hTERT后待细胞汇合至80%时,传至另一个24孔培养板中，48h后用G418筛选液进行G418筛选；待对照孔的细胞全部死亡后，将G418筛选液的浓度降低维持G418筛选，将G418筛选阳性的克隆细胞接种到96孔培养板中，然后消化传代至24孔培养板扩大培养，继续进行G418筛选，得抗G418的阳性细胞；(4)将步骤(3)所得抗G418的阳性细胞于培养箱内进行体外连续传代培养，培养超过60代，获得永生化的牛睾丸细胞系；所述体外连续传代培养采用消化法。上述牛睾丸细胞系的建立方法，其特征在于，还包括细胞冻存步骤，该步骤按顺序如下:更换步骤(4)培养瓶内的培养基，继续培养；用胰酶消化培养细胞,然后加入培养基终止反应；计数；收集:离心，去上清液，加入冻存液，混匀，使细胞重悬，将培养的细胞分装入冻存管封口 ；预冻:4°C预冻冻存管30~60min，_20°C预冻I~2h，_70°C预冻6~12h ;冻存:将_70°C预冻的冻存管迅速投入液氮柜中； 所述的冻存液的各成分所占体积百分比为:10%DMS0、60%胎牛血清和30%DMEM。上述牛睾丸细胞系的建立方法，其特征在于，步骤(1)所述的培养是指高活力的牛睾丸细胞培养于完全的DMEM培养基中；所述完全的DMEM培养基为向液态DMEM培养基中加入体积比为10%的胎牛血清的DMEM培养基；所述的液态DMEM培养基可以使用直接购买的该液体培养基，也可以是使用购买的DMEM培养基干粉配制而成。上述牛睾丸细胞系的建立方法，其特征在于，所述转染包括如下步骤:(I)转染前24h，将牛睾丸细胞用消化成单个细胞，接种到24孔板内，使细胞在转染当天能达到80%~90%的融合；(2)转染前4h，将完全的DMEM培养基更换成液态DMEM培养基；(3)用液态DMEM培养基将三份5 μ L的pC1-neo-hTERT质粒均稀释至50 μ L，得稀释的质粒DNA ；(4)用液态 DMEM 培养基分别稀释 6 μ L、9 μ L、12 μ L 的 Lipofectamine2000 到50 μ L,得稀释的 Lipofectamine2000 ；(5)分别混合步骤(3)的稀释的质粒DNA和步骤(4)的稀释的Lipofectamine2000,得混合物；(6)吸出步骤(1)的24孔板中的培养基，用D-Hank’s清洗，加入900 μ L液态DMEM培养基；(7)加入步骤(5)的混合物到不同孔中，混匀；同时设立空白对照；(8)于体积分数为5% CO2饱和湿度培养箱中孵育，弃去培养基，加入完全的DMEM培养基;(9)观察细胞，并及时换液。本专利技术牛睾丸细胞系具有以下特征:细胞生长速度快，生长健康，形态良好，细胞凋亡率低。细胞纯度在99.9%以上，细胞活率不小于92.8%。本专利技术牛睾丸细胞系的生物学特性检测各项指标均达到美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection,ATCC)细胞系鉴定标准,且外源基因在牛睾丸细胞系中的表达率在40%以上。本专利技术牛睾丸细胞系的建立方法中，步骤(1)中所述的初生牛睾丸组织效果最佳。本专利技术牛睾丸细胞系的建立方法中，胰酶消化的具体步骤是:向培养瓶内加入2.5g/L胰酶1.5~2.5mL，倒置培养瓶于温箱中预热至37°C后后翻转消化30~60S。本专利技术牛睾丸细胞系的建立方法中，根据实际需要可以将冻存的细胞进行复苏，具体步骤为:将冻存管从液氮中取出置入38°C水浴中，晃动I分种后，将细胞移入加有完全的DMEM培养基的培养瓶中吹打均匀，放置含37°C，5%C02的CO2培养箱中继续培养48h后即可继续传代培养。本专利技术的优点与效益:本专利技术对于贴壁培养方法及培养基成分的改进调整本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牛睾丸细胞系，其保藏号为：CCTCC C201399。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王文秀，沈志强，管宇，魏凤，
申请(专利权)人：山东省滨州畜牧兽医研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37