一种高效表达禽法氏囊病毒VP2蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种高效表达禽法氏囊病毒VP2蛋白的方法。方法为将表达菌株的种子液接种至发酵罐中，于32

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达禽法氏囊病毒VP2蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及发酵工程
，具体涉及一种高效表达禽法氏囊病毒VP2蛋白的方法。

技术介绍

[0002]鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病，该病毒主要侵害雏鸡和青年鸡的淋巴组织，尤其是法氏囊等中枢免疫器官，可造成法氏囊组织出现严重病理损伤，进而导致机体发生严重的免疫抑制，极易导致继发感染或使多种疫苗免疫失败，给养鸡业造成巨大的损失。
[0003]IBDV属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属，基因组由两个长度不相同的双股RNA（Double
‑
strand RNA，dsRNA）组成。A节段编码一个110kDa的多聚蛋白和一个17kDa的非结构蛋白（NS或者VP5）。多聚蛋白被翻译出后，由蛋白水解酶VP4剪切成pVP2（49kDa），VP3（32kDa）和VP4（28kDa）。VP2和VP3是病毒主要的结构蛋白，其中VP2蛋白占蛋白总含量的51%，位于病毒粒子的外表面，与抗原性和毒力的变异、细胞嗜性、致病性、细胞凋亡等密切相关，具有IBDV所有的中和表位，诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受IBDV感染。目前，已有相关研究人员基于大肠杆菌、重组火鸡疤疹病毒、酵母、禽痘病毒等表达系统开发基因工程疫苗。但都存在以下缺陷，如大肠杆菌表达的VP2蛋白多以包涵体形式存在，必须经过变性复性，另外，大肠杆菌表达的VP2抗原往往采取IPTG诱导方式，但IPTG有一定毒性，重组活载体疫苗不仅存在实验室和生产过程中的安全问题，并且其与普通活疫苗一样发生基因突变和重组的几率较高。因此研制一种生产成本低、安全效率高、能可溶性表达并具备良好免疫原性的基因工程疫苗，具有重要的现实意义。
[0004]目前，已有将温控表达蛋白方法应用于禽法氏囊病VP2发酵生产的相关研究。程太平等人采用摇瓶培养进行了优化分析，但琼扩效价低，潘群兴等人对VP2基因进行了密码子优化，但表达蛋白主要以包涵体为主，且没有进行效价检测；王海波等人采用发酵罐温控表达粒菌体集落刺激因子（Granulocyte Colony
‑
Stimulating Factor，G
‑
CSF）。但目前仍缺乏采用发酵罐温控表达VP2蛋白的工业化生产相关研究。

技术实现思路

[0005]针对传统IPTG诱导方式使用有毒试剂的技术问题，本专利技术提供一种高效表达禽法氏囊病毒VP2蛋白的方法，在升温诱导时添加培养保护液，可高效表达可溶性VP2蛋白，蛋白效价可得到3
‑
4倍的提高，且培养基成本低廉，发酵工艺简单易行，为工业化生产VP2疫苗奠定了坚实的基础。
[0006]本专利技术技术方案如下：一种高效表达禽法氏囊病毒VP2蛋白的方法，将表达菌株的种子液接种至发酵罐中，于32
‑
37℃下开始发酵，待发酵液OD
600
值≥3时，即菌体处于对数生长前期时，加入培养
保护液，提高发酵温度至40
‑
42℃，开始升温诱导，直至发酵结束；培养保护液包括100g/L海藻糖和100g/L谷氨酸钠。
[0007]进一步的，培养保护液的加入量≥10mL/1L发酵体积。
[0008]进一步的，升温诱导1
‑
5h后结束发酵。
[0009]进一步的，初始发酵温度为35℃，升温诱导为42℃，升温诱导3
‑
4h后结束发酵。
[0010]进一步的，发酵过程中控制pH值为6.7
‑
7.0，溶氧为30
‑
50%，通气量为2
‑
8L/min，搅拌转速为200
‑
800r/min。
[0011]进一步的，发酵罐所使用的发酵培养基原料包含5g/L酵母浸出物、10g/L胰蛋白胨、8g/L NaCl、3g/L Na2HPO4·
12H2O，发酵培养基的pH值为7.5。
[0012]进一步的，当发酵培养基中糖类耗完，pH值升高到7.5时，流加500g/L的葡萄糖溶液，维持发酵液中残糖浓度在1
‑
2g/L。
[0013]进一步的，表达菌株为基因工程菌，按如下步骤获得：S1、用EcoR I和Sal I双酶切含有目的基因的pMD18T
‑
vp2载体，获得目的片段，胶回收纯化目的片段，目的基因序列如SEQID NO.2所示；S2、双酶切pBV220载体并胶回收；S3、用T4 DNA连接酶将目的基因片段（VP2）和双酶切pBV220载体得到的质粒片段连接；S4、转化表达菌感受态，如E.coli DH5a感受态，即得。
[0014]本专利技术的有益效果在于：本专利技术采用温控诱导方式表达禽法氏囊病毒VP2重组蛋白，在升温诱导过程中添加培养保护液减小热应激，优化了相应的发酵条件，效价结果达到26，与传统IPTG诱导方式诱导结果相当，具有生产成本低，产品毒副作用小的优点。
[0015]本专利技术方法能够在发酵液OD
600
值≥3时进行诱导，菌体生长活跃，表达效率高。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0017]图1是pBV220
‑
VP2质粒结构示意图。
[0018]图2是DH5α/pBV220
‑
VP2诱导表达产物的琼扩效价结果图。
[0019]图3是DH5α/pBV220
‑
VP2诱导表达产物的SDS
‑
PAGE分析。
具体实施方式
[0020]为了使本
的人员更好地理解本专利技术中的技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。
[0021]如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
[0022]实施例1 表达菌株的构建以禽法氏囊病毒SH95株基因组（AY134874）为模板设计VP2蛋白表达基因序列（SEQ ID NO.1），长度为1359bp。
[0023]SEQ ID NO.1序列如下：atgacgaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatgccaacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctagagaagc本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达禽法氏囊病毒VP2蛋白的方法，其特征在于，将表达菌株的种子液接种至发酵罐中，于32
‑
37℃下开始发酵，待发酵液OD
600
值≥3时，加入培养保护液，提高发酵温度至40
‑
42℃，开始升温诱导，直至发酵结束；培养保护液包括100g/L海藻糖和100g/L谷氨酸钠。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，培养保护液的加入量≥10mL/1L发酵体积。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，升温诱导1
‑
5h后结束发酵。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，初始发酵温度为35℃，升温诱导为42℃，升温诱导3
‑
4h后结束发酵。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵过程中控制pH值为6.7
‑
7.0，溶氧为30
‑
50%，通气量为2
‑
8L/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：付强，程立坤，付石军，赵修报，于金枝，张兵，沈志强，
申请(专利权)人：山东省滨州畜牧兽医研究院，
类型：发明
国别省市：