一种用于保存CIK细胞的冻存液及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于保存CIK细胞的冻存液及其应用。本发明专利技术提供的用于保存CIK细胞的冻存液，是按照如下方法制备得到的：在淋巴细胞无血清培养基中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的体积百分含量为5-15%，使右旋糖苷的体积百分含量为5-15%。与冻存前的细胞相比，采用本发明专利技术提供的冻存液冻存后的细胞：（1）细胞形态无明显差异；（2）免疫表型（CD3+CD56+和CD8+）无明显差异；（3）细胞增殖活力、细胞杀伤活性无明显差异。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于保存CIK细胞的冻存液及其应用。
技术介绍
CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-1nduced killer cells),是一种非MHC限制性的高效溶肿瘤细胞毒性T淋巴细胞，在外周血淋巴细胞中的比例为1%_5%。1991年Schmidt-Wolf等首先报道了一类由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，即CIK细胞。目前,免疫细胞过继疗法已成为放、化疗后对肿瘤患者进行辅助治疗的重要手段之一，CIK细胞是过继治疗的主力军。通常采用自体外周血制备CIK，一方面CIK细胞数量不足，另一方面会加重患者体质虚弱，使机体处于免疫系统薄弱时期，易引起感染。脐血来源丰富，细胞增殖能力强，是较为理想的CIK细胞来源。因此，CIK细胞的保存技术很值得研究。CIK细胞培养周期较长，易污染，不利于其临床应用，因此寻找一种CIK细胞保存方法尤为重要。人类的CIK细胞是一群异质性细胞群，已有研究证实⑶3+⑶56+细胞和⑶8+杀伤T细胞是构成CIK细胞强大杀瘤活性的主要效应细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于保存CIK细胞的冻存液及其应用。本专利技术提供的用于保存CIK细胞的冻存液，是按照如下方法制备得到的:在淋巴细胞无血清培养基中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的体积百分含量为5-15%(如5-10%、10-15%、5%、10%或15%)，使右旋糖苷的体积百分含量为5-15%(如5_10%、10_15%、5%、10% 或 15%) ο所述淋巴细胞无血清培养基具体可为GT-T551，具体可为购自日本TAKARA BIOINC货号为GT-T551的GT-T551培养液。本专利技术提供的冻存液中，添加了右旋糖苷作为细胞外的非渗透性保护物质，在冷冻过程中可减少细胞内冰晶的 形成，复苏时还可以减轻由于渗透压的改变而引起的细胞肿胀。本专利技术发现，右旋糖苷与DMSO的联合使用能发挥叠加或协调低温保护作用。右旋糖苷输注在临床上原本就被用于扩充血容量，且目前未发现对人体有副作用。本专利技术还保护所述冻存液在保存CIK细胞中的应用。本专利技术还保护一种保存CIK细胞的方法，包括如下步骤:用所述冻存液悬浮CIK细胞，得到细胞悬液，然后冷冻保存所述细胞悬液。所述方法中，所述细胞悬液中的细胞浓度可为IO8个细胞/ml的细胞悬液。所述冷冻保存的步骤可为:将所述细胞悬液采用程控降温仪降温后置于液氮中保存。所述程控降温仪的降温参数可为:4°C -40°C，I 2°C /每分钟；-40°C -80°C，10°C /每分钟。在液氮中保存的时间具体可为180天以内。与冻存前的细胞相比，采用本专利技术提供的冻存液冻存后的细胞:(I)细胞形态无明显差异；(2)免疫表型(⑶3+CD56+和⑶8+)无明显差异；(3)细胞增殖活力、细胞杀伤活性无明显差异。结果表明，本专利技术提供的冻存液显著优于传统冻存液。附图说明图1为实施例2中冻存前的细胞和复苏后的细胞在倒置显微镜下的照片(X 200)。图2为实施例2中各组CIK细胞的一次流式检测结果。图3为实施例2中各组细胞的生长曲线。图4为实施例2中各组CIK细胞的细胞毒性比较。图5为实施例3中冻存前的细胞和复苏后的细胞在倒置显微镜下的照片(X200)。图6为实施例3中各组CIK细胞的一次流式检测结果。图7为实施例3中各组细胞的生长曲线。图8为实施例3中各组CIK细胞的细胞毒性比较。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中的统计学方法均为用SPSS10.0软件进行t检验和方差分析。K562细胞(人慢性髓系白血病细胞):购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心，资源编号:3111C0001CCC000039。Ficoll淋巴细胞分离液:美国Sigma公司，货号:10771。淋巴细胞无血清培养基，又称GT-T551培养液:日本TAKARA BIO INC，货号:GT-T551。细胞因子IFN-Y:Gibco公司，货号:PHC4033o 细胞因子 IL-2: ，Gibco 公司，货号:CTP0021。CD3 单抗(CD3mAb) =Gibco公司，货号:MHCD0300。FITC标记的⑶3抗体、PE标记的⑶56抗体、PE标记的⑶8抗体、FITC标记的IgGl抗体和PE标记的IgGl抗体均购自美国beckman coulter。二甲基亚砜(DMSO):Gibco公司，货号:C6295。右旋糖苷(Dextran ;分子量为40000):山东齐都药业有限公司，批号:1012030406。实施例1、细胞冻存液的制备细胞冻存液甲的制备方法:在GT-T551细胞培养液中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的浓度为10% (体积比)，使右旋糖苷的浓度为10% (体积比)。细胞冻存液乙的制备方法:在GT-T551细胞培养液中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的浓度为5% (体积比)，使右旋糖苷的浓度为15% (体积比)。细胞冻存液丙的制备方法:在GT-T551细胞培养液中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的浓度为15% (体积比)，使右旋糖苷的浓度为5% (体积比)。细胞冻存液丁 (传统的细胞冻存液):在GT-T551细胞培养液中加入二甲基亚砜和人血白蛋白，使二甲基亚砜的浓度为15% (体积比)，使人血白蛋白的浓度为10% (体积比)。实施例2、CIK细胞的获得和冻存一、CIK细胞的获得脐带血:获自新乡医学院足月健康胎儿，征得家属同意。1、采用Ficoll淋巴细胞分离液(密度梯度离心法)从脐带血中分离单个核细胞。2、将步骤I得到的单个核细胞在IOOml含有1000 μ g/ml IFN- Y和1% (体积比)自体血浆(即用于分离核细胞的脐带血血浆)的GT-T551细胞培养液中37°C静置培养24小时。3、在完成步骤2的培养体系中加入⑶3单抗和细胞因子IL-2，使⑶3单抗的浓度为75ng/ml、细胞因子IL-2的浓度为1000U/ml，37°C静置培养24小时。4、在完成步骤3的培养体系中加入300ml含有1000U/ml细胞因子IL-2的GT-T551细胞培养液，之后每48小时加入200ml含有1000U/ml细胞因子IL-2的GT-T551细胞培养液，培养条件为37°C静置培养。二、CIK细胞的冻存1、步骤一中，从步骤2接种单个核细胞开始计时，每24小时为I天，14天后收集CIK细胞(即冻存前的细胞)。2、分组冻存处理实验组甲:用细胞冻存液甲悬浮步骤I得到的CIK细胞，得到IO8个细胞/ml的细胞悬液，每个冻存管加入Iml细胞悬液。实验组乙:用细胞冻存液乙悬浮步骤I得到的CIK细胞，得到IO8个细胞/ml的细胞悬液，每个冻存管加入Iml细胞悬液。实验组丙:用细 胞冻存液丙悬浮步骤I得到的CIK细胞，得到IO8个细胞/ml的细胞悬液，每个冻存管加入Iml细胞悬液。对照组:用细胞冻存液丁悬浮步骤I得到的CIK细胞，得到IO8个细胞/ml的细胞悬液，每个冻存管加入Iml细胞悬液。3、将步骤2得到的各个冻存本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于保存CIK细胞的冻存液，是按照如下方法制备得到的：在淋巴细胞无血清培养基中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的体积百分含量为5?15%，使右旋糖苷的体积百分含量为5?15%。

【技术特征摘要】
1.用于保存CIK细胞的冻存液，是按照如下方法制备得到的:在淋巴细胞无血清培养基中加入二甲基亚砜和右旋糖苷，使二甲基亚砜的体积百分含量为5-15%，使右旋糖苷的体积百分含量为5-15%。2.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于:所述二甲基亚砜的...

【专利技术属性】
技术研发人员：官立萍，姬明丽，千智斌，李振想，武文杰，李霞飞，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：