本发明专利技术公开了一种提高牛腔前卵泡体外发育的培养基及其应用。本发明专利技术提供制备促进离体哺乳动物腔前卵泡体外发育的培养基的方法，为将胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、丙酮酸钠、谷氨酰胺、次黄嘌呤、血清、促卵泡素、促黄体素、雌激素、PTEN抑制剂和α-MEM培养基混合，得到培养基。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术首先从卵巢皮质分离牛腔前卵泡，随后将获取的卵泡在本发明专利技术提供的培养基和对照培养基中进行体外培养，观察其直径增长以及卵泡的成腔率，结果发现，本发明专利技术提供的培养基培养得到成腔率和直径增长值均高于对照，为进一步挖掘雌性生殖资源提供必要的培养体系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及畜牧学(动物繁殖)，尤其涉及一种提高牛腔前卵泡体外发育的培养基及其应用。
技术介绍
牛卵巢上有数万个原始卵泡，在其生长成熟过程中，有相当数量的卵泡退化、闭锁，仅有极少数的卵泡发育到成熟阶段，直至排卵。在雌性生殖资源中，卵母细胞是体外受精、胚胎移植、性别控制、胚胎分割、动物克隆和转基因等胚胎生物技术研究和开发必不可少的材料，卵母细胞来源匮乏成为制约这些技术研究进展的主要因素，因此卵巢腔前卵泡的开发无疑是解决这一难题的有效途径。与普通的体细胞培养和来自有腔阶段的卵泡卵母细胞的体外成熟培养比较，哺乳动物腔前卵泡的体外培养难度更大。尽管如此，1989年Eppig等用两步法体外培养小鼠腔前卵泡，获得成熟卵母细胞并成功产下正常后代，自此人们先后在其它动物上开始了腔前卵泡体外培养的研究。特别是在牛、羊、猪等家畜方面研究较多，并且在研究内容、手段和方法上都取得了一些进展。但是到目前为止，仍未建立起一套牛腔前卵泡体外培养的体系。因此，进一步优化和建立牛腔前卵泡体外培养体系显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种制备促进离体哺乳动物腔前卵泡体外发育的培养基的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤将胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、丙酮酸钠、谷氨酰胺、次黄嘌呤、血清、促卵泡素、促黄体素、雌激素、PTEN抑制剂、水和α-MEM培养基混合，得到培养基，所述胰岛素在所述培养基中的浓度为5ug/ml，所述转铁蛋白在所述培养基中的浓度为5ug/ml，所述亚硒酸钠在所述培养基中的浓度为5ng/ml ；所述丙酮酸钠在所述培养基中的浓度为(0.21-0.29)mmol/l，所述谷氨酰胺在所述培养基中的浓度为 (1.5-2.0)mmOl/l，所述次黄嘌呤在所述培养基中的浓度为(1. 8_2. Qmmol/l，所述血清在所述培养基中的浓度为5% -10% (体积百分含量)，所述促卵泡素在所述培养基中的浓度为0. 25μ g · Hir1-O. 5μ g · ml—1，所述促黄体素在所述培养基中的浓度为5IU ml^-lOIU πιΓ1，所述雌激素在所述培养基中的浓度为0. 5μ g ^mr1-L 0μ g ^mr1,所述PTEN抑制剂在所述培养基中的浓度为lOOnmol/L-lO μ mol/L,所述α -MEM培养基在所述培养基中的浓度为 10. lg/L。所述丙酮酸钠在所述培养基中的浓度为0. 21mmol/l、0. 23mmol/l或0. 29mmol/ 1 ；所述谷氨酰胺在所述培养基中的浓度为1. 5mmol/lU. 8mmol/l或2. Ommol/1，所述次黄嘌呤在所述培养基中的浓度为1. 8mmol/l,2mmol/l或2. 5mmol/l，所述血清在所述培养基中的浓度为5%、7.5%或10% (体积百分含量)，所述促卵泡素在所述培养基中的浓度为 0. 25μ g · mr\0.4yg · πιΓ1或0. 5 μ g · πιΓ1，所述促黄体素在所述培养基中的浓度为5IUmr\8IU ml—1或IOIU ml—1，所述雌激素在所述培养基中的浓度为0. 5 μ g ·πιΓ\θ.8μδ -πιΓ1 或1. 0 μ g · πιΓ1，所述PTEN抑制剂在所述培养基中的浓度为lOOnmol/L、1 μ mol/L或 10 μ mol/Lo所述血清为胎牛血清；所述雌激素为雌激素E2 ；所述PTEN抑制剂为PTEN抑制剂pic。所述哺乳动物为牛。所述的方法制备的培养基也是本专利技术保护的范围。所述的培养基在促进离体哺乳动物腔前卵泡体外发育中的应用。所述哺乳动物为牛。所述离体哺乳动物腔前卵泡体外发育通过增加卵泡直径和/或提高卵泡成腔率体现。所述α -MEM培养基可商购，也可按照如下方法制备200. 00mg/L氯化钙(无水)、 400. 00mg/L 氯化钾、98. 00mg/L 氯化镁(无水)、6，800. 00mg/L 氯化钠、140. 00mg/L 一水合磷酸氢二钠、1，000. 00mg/L D-葡萄糖、0. 20mg/L 硫辛酸、10. 00mg/L 酚红、110. 00mg/L 丙酮酸钠、25. 00mg/L L-丙氨酸；127. 00mg/L L-精氨酸盐酸盐、50. 00mg/LL-天冬氨酸一水合物、30.00mg/L L-天冬氨酸、31.00mg/L L-胱氨酸二盐酸盐、100. 00mg/L L-半胱氨酸盐酸盐一水合物、75. 00mg/L L-谷氨酸、292. 00mg/L L-谷氨酰胺、50. 00mg/L L-甘氨酸、42. 00mg/L L-组氨酸盐酸盐一水合物、52. 00mg/L L-异亮氨酸、52. 00mg/L L-亮氨酸、 73. 00mg/L L-赖氨酸盐酸盐、15. 00mg/L L-甲硫氨酸、32. 00mg/LL-苯丙氨酸、40. 00mg/L L-脯氨酸、25. 00mg/L L-丝氨酸、48. 00mg/L L-苏氨酸、10. 00mg/L L-色氨酸、52. OOmg/ L L-酪氨酸(二钠盐),46. 00mg/L L-缬氨酸、50. 00mg/L L-抗坏血酸、0. 10mg/L生物素、 1. 00mg/L泛酸钙、1. 00mg/L氯化胆碱、1. 00mg/L叶酸、2. 00mg/L内消旋肌醇、1. 00mg/L烟酰胺、1. 00mg/L盐酸吡哆醛、0. 10mg/L核黄素、1. 00mg/L盐酸硫胺、1. 40mg/L维生素B12和水混合，得到培养基。本专利技术的另一个目的是提供一种体外培养获得有腔卵泡的方法的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤将离体哺乳动物腔前卵泡在所述的培养基中培养，得到有腔卵泡。所述培养的温度为39°C，所述培养在5% CO2条件下进行，所述培养的时间为21天。本专利技术的实验证明，本专利技术首先从卵巢皮质分离牛腔前卵泡，随后将获取的卵泡在本专利技术提供的培养基和对照培养基中进行体外培养，观察其直径增长以及卵泡的成腔率，结果发现，本专利技术提供的培养基培养得到成腔率和直径增长值均高于对照，为进一步挖掘雌性生殖资源提供必要的培养体系。通过本专利技术，可为研究牛早期腔前卵泡发育的研究人员提供一套完整有效地体外培养体系，为进一步研究其卵母细胞体外成熟机制奠定基础。本专利技术简捷、高效、便于推广。附图说明图1为不同浓度的pic对牛腔前卵泡成腔率的影响具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、新的培养体系的获得1、腔前卵泡的获取将屠宰场获取的离体牛卵巢置于60mm直径的玻璃平皿中，去除多余系膜和黄体，随后将卵巢沿着卵巢门一切为二，去除髓质，在培养基(M199培养基， GIBC0，货号31100-035)中清洗2次后，用刀具按照横向和纵向两个方向从卵巢皮质部划取卵泡，将获取的卵泡和培养基用滴管吹打，然后用直径Imm的吸管吹打80 100次，经 200 μ m网筛过滤，再用直径0. 5mm吸管吹打80-100次，用100 μ m网筛过滤，以1500r/min 离心5min，除去上清液，其沉淀加入分离液稀释悬浮，体视显微镜下镜检卵泡、计数并测量直径；结果为卵泡数为每个卵巢12本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种制备促进离体哺乳动物腔前卵泡体外发育的培养基的方法，为将胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、丙酮酸钠、谷氨酰胺、次黄嘌呤、血清、促卵泡素、促黄体素、雌激素、ＰＴＥＮ抑制剂、水和α－ＭＥＭ培养基混合，得到培养基，所述胰岛素在所述培养基中的浓度为５ｕｇ／ｍｌ，所述转铁蛋白在所述培养基中的浓度为５ｕｇ／ｍｌ，所述亚硒酸钠在所述培养基中的浓度为５ｎｇ／ｍｌ；所述丙酮酸钠在所述培养基中的浓度为（０．２１－０．２９）ｍｍｏｌ／ｌ，所述谷氨酰胺在所述培养基中的浓度为（１．５－２．０）ｍｍｏｌ／ｌ，所述次黄嘌呤在所述培养基中的浓度为（１．８－２．５）ｍｍｏｌ／ｌ，所述血清在所述培养基中的浓度为５％－１０％（体积百分含量），所述促卵泡素在所述培养基中的浓度为０．２５μｇ·ｍｌ－１－０．５μｇ·ｍｌ－１，所述促黄体素在所述培养基中的浓度为５ＩＵ ｍｌ－１－１０ＩＵｍｌ－１，所述雌激素在所述培养基中的浓度为０．５μｇ·ｍｌ－１－１．０μｇ·ｍｌ－１，所述ＰＴＥＮ抑制剂在所述培养基中的浓度为１００ｎｍｏｌ／Ｌ－１０μｍｏｌ／Ｌ，所述α－ＭＥＭ培养基在所述培养基中的浓度为１０．１ｇ／Ｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李向东，李冬冬，孙婧，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11
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