一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法技术

本发明专利技术涉及一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法，操作步骤如下：1）利用体内和体外实验确定激活素A发挥作用的关键时期是出生前12天到出生后7天；2）利用细胞荧光染色和western?blot检测减数分裂相关蛋白的表达情况，确定激活素A促进雌性生殖细胞第一次减数分裂的进程；3）利用免疫荧光组化的方法统计各组中原始卵泡形成情况，激活素A促进原始卵泡库的建立。本发明专利技术方法原理可靠，操作简单，激活素A在卵母细胞发生早期起重要作用，它使雌性生殖嵴中保持相对高浓度的视黄酸，视黄酸在雌性生殖细胞中促进了Stra8基因的表达，加速了雌性生殖细胞减数分裂启动及进程，促进了原始卵泡的形成。

【技术实现步骤摘要】
一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法
:本专利技术涉及一种激活素A (Activin A)促进雌性生殖细胞第一次减数分裂进程的方法，从而促进哺乳动物原始卵泡库的建立，特别是涉及一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法。属于生殖医学的生物医学
。
技术介绍
: 随着全球工业化的急剧发展和环境污染的持续加重，不孕不育夫妇的比例逐渐增加，胎儿出生缺陷发生率居高不下。我国女性不孕不育、卵巢早衰及先天出生缺陷等疾病发生率也呈现逐渐升高的趋势。研究者对不孕不育和先天出生缺陷的发病原因进行了大量的探索研究后发现，这些卵巢性生殖疾病发生的主要原因之一是卵子发生过程中减数分裂发生或染色体分离异常从而导致原始卵泡库中卵母细胞的数目降低。然而，最初人们主要关注出生后卵泡的生长、发育与成熟，而对减数分裂启动以及原始卵泡形成的调控机制还了解很少。另外，原始卵泡形成的数量及其消耗的效率决定了雌性动物的繁殖使用时间的长短。因此，为了尽早地启动动物繁殖周期、开发最大量的原始卵泡或推迟女性更年期的来临、治疗卵巢功能性不育，研究卵母细胞发生过程中减数分裂启动、原始卵泡形成和募集显得非常重要。激活素A是TGF-β超家族成员，在哺乳动物卵子发生过程中发挥着重要的作用，在不同时间调节多种细胞中相关基因的表达。近年的研究主要集中在激活素A调节卵泡颗粒细胞增殖，激活素A可刺激卵巢颗粒细胞增生和成熟，用己烯雌酚处理未成熟大鼠颗粒细胞表明，激活素A可增强FSH (促卵泡素)，刺激芳香酶的活性，促进孕酮及抑制素的产生(Eppig et al, 1994)。用激活素A处理卵巢碎片可刺激卵原细胞的增殖(Martins da etal, 2004)等。目前，在激活素A参与调节减数分裂前生殖细胞形成原始卵泡库方面还未有研究报道。本研究借助胎鼠生殖嵴体外发育模型，深入研究激活素A与雌性生殖细胞原始卵泡库形成之间的关系，具有很大的实际应用价值。
技术实现思路
:本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法，使激活素A在体内和体外条件下都可以促进动物原始卵泡库的形成。为了实现上述专利技术目的，本专利技术方法利用免疫组织化学、定量PCR及蛋白印迹技术检测了激活素A的I型和II型受体在12.5dpc、0dpp、7dpp、14dpp和21dpp小鼠卵巢发育过程中的定位和表达变化，结果显示激活素A的I型和II型受体在12.5dpc到7dpp小鼠卵巢中有明显的表达峰；再利用12.5dpc雌性胎鼠生殖嵴体外培养，在12.5dpc到7dpp期间持续添加激活素A显著提高卵母细胞数量、直径和质量(P〈0.05);在12.5dpc雌性胎鼠生殖嵴体外培养过程中，激活素A可促进卵母细胞第一次减数分裂前期的进程(P〈0.05)，使减数分裂相关基因Stra8、Dazl、Dmcl和Scp3在基因水平表达量显著升高(P〈0.05)，Stra8、Scp3和Dazl蛋白表达量显著升高(P〈0.05)。对妊娠第10d的母鼠静脉注射激活素A,激活素A促进卵原细胞第一次减数分裂前期进程，减数分裂相关基因表达量也显著升高(P〈0.05)。12.5dpc小鼠卵巢体外培养10天后，激活素A促进生殖细胞Cyst的解聚和原始卵泡形成。本专利技术的一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法，按照如下步骤操作:1)利用体内和体外实验确定激活素A发挥作用的关键时期是出生前12天到出生后7天:利用机械法分离12.5dpc的胎鼠卵巢组织在37°C、5%C02、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，培养液A包含88%( α -MEM), 10%胎牛血清(FCS)，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU促卵泡素(FSH);培养分为四个阶段，每个阶段7天，共28天；在每个阶段分别设置不添加激活素A组，培养到28天时，收集胎鼠卵巢，并撕成碎小的组织块，0.25%胰酶，0.2%胶原酶IV，37°C处理lOmin，加入终止液(10%的胎牛血清+90%的DMEM)后洗涤3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸盐缓冲液(PBS)中反复洗涤，直至收集的样品中不再含有颗粒细胞；然后统计不同组的卵母细胞数目和直径大小；发现激活素A从小鼠出生前12天开始到出生后7天都发挥重要作用；为了更准确地了解激活素I型和II型受体在整个卵巢发生过程中的定位和表达模式，分别采用定量PCR和蛋白印迹方法对其转录和翻译水平的表达量进行分析:定量PCR结果表明:在12.5dpc的胎鼠卵巢中可检测到激活素受体IA、IB、IIA和IIB的表达，且随着卵母细胞发育，激活素受体IA和IB在7dpp时表达量达到峰值，与出生前卵巢中激活素受体IA和IB的表达量相比，差异极显著(P〈0.01);而激活素受体IIA和IIB表达量到Odpp时达到峰值，与出生前卵母细胞中的表达量相比，差异极显著(P < 0.05);检测7dpp的卵巢发现激活素受体IIA和IIB表达呈现下降的趋势，但相较其它时期仍处于较高表达水平；卵巢发育到14dpp时，激活素受体IA、IB、IIA和IIB表达水平都降到最低值，与Odpp或7dpp时相比差异显著(P<0.05);另外，蛋白印迹分析结果显示，激活素受体IB和IIB在翻译水平的表达趋势与转录水平基本一致；所述胎鼠卵巢组织的分离按照如下步骤操作:胎鼠卵巢来源于12.5dpc的孕鼠，孕鼠的判定以见栓为0.5dpc，利用机械分离法从胎鼠体内分离出卵巢，并转移到磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.2)+10%胎牛血清(FCS)的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手术镊子去掉与卵巢连接在一起的中肾组织，在新鲜培养液88% α -MEM, 5%胎牛血清(FCS)，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU/ml的促卵泡素(FSH)中将卵巢洗3次；2)利用细胞荧光染色和western blot检测减数分裂相关基因和蛋白的表达情况，确定激活素A促进雌性生殖细胞第一次减数分裂的进程:12.5dpc胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作:生殖嵴分离出来培养的当天定为0天，分离出的12.5dpc胎鼠生殖嵴，在37°C、5%C02、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，贴壁培养4天，对照组培养液包含88%( α -MEM), 10%胎牛血清(FCS)，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU促卵泡素(FSH);激活素A组培养液包含88%( α -MEM), 10%胎牛血清(FCS)，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU促卵泡素(FSH)，100ng/ml激活素A ;激活素A加抑制剂组培养液包含88% ( α -MEM), 10%胎牛血清(FCS)，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU促卵泡素(FSH)，100ng/ml激活素Α，5μ ΜSB431542 ;妊娠10天的母鼠通过静脉注射二甲基亚砜(DMS0)、60ng/kg和100ng/kg的激活素A，4天后检测，通过实时荧光定量PCR、细胞荧光染色和western blot检测手段，确定激活素A加速第一次减数分裂的进·程；3)利用免疫荧光组化的方法统计各组中原始卵泡的形成情况，激活素A促进原始卵泡库的建立:12.5dpc胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作:分离出12.5dpc胎鼠生殖嵴，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法，其特征在于按照如下步骤操作：1）利用体内和体外实验确定激活素A发挥作用的关键时期是出生前12天到出生后7天：利用机械法分离12.5dpc的胎鼠卵巢组织在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，培养液A包含88%α?MEM，10%胎牛血清，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU促卵泡素；培养分为四个阶段，每个阶段7天，共28天；在每个阶段分别设置不添加激活素A组，培养到28天时，收集胎鼠卵巢，并撕成碎小的组织块，0.25％胰酶，0.2％胶原酶IV，37℃处理10min，加入10%的胎牛血清+90%的DMEM配成的终止液后洗涤3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸盐缓冲液中反复洗涤，直至收集的样品中不再含有颗粒细胞；然后统计不同组的卵母细胞数目和直径大小；发现激活素A从小鼠出生前12天开始到出生后7天都发挥作用；2）利用细胞荧光染色和western?blot检测减数分裂相关基因和蛋白的表达情况，确定激活素A促进雌性生殖细胞第一次减数分裂的进程：12.5dpc胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作：生殖嵴分离出来培养的当天定为0天，分离出的12.5dpc胎鼠生殖嵴，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，贴壁培养4天，培养液包含88%α?MEM，10%胎牛血清，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU促卵泡素，100ng/ml激活素A；通过实时荧光定量PCR、细胞荧光染色和western?blot检测手段，确定激活素A加速第一次减数分裂的进程；3）利用免疫荧光组化的方法统计各组中原始卵泡的形成情况，激活素A促进原始卵泡库的建立：12.5dpc胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作：分离出12.5dpc胎鼠生殖嵴，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱里培养，培养液成分同步骤2）；每两天换半液，悬浮培养4天后转为体外立体培养6天，通过荧光免疫组化检测发现激活素A促进在体外培养条件下的原始卵泡库形成；结果表明，激活素A加速体内原始卵泡库的建立；4）激活素A对雌性生殖细胞第一次减数分裂相关基因和蛋白的影响：利用RT?qPCR方法检测减数分裂相关基因Stra8、Dazl、Scp3、Rec8、Spoll和Dmc1的变化，激活素A处理组的Stra8表达量极显著升高，Dazl、Scp3和Dmc1表达量显著升高；借助免疫细胞化学检测技术，利用MVH标记生殖细胞后检测了生殖细胞DAZL和STRA8的阳性率，发现激活素A显著增加了表达DAZL和STRA8的生殖细胞比例；同时，Western?blot结果显示，添加激活素A后，DAZL、SCP3和STRA8减数分裂相关蛋白都显著升高。...

【技术特征摘要】
1.一种激活素A促进原始卵泡库形成的方法，其特征在于按照如下步骤操作:1)利用体内和体外实验确定激活素A发挥作用的关键时期是出生前12天到出生后7天:利用机械法分离12.5dpc的胎鼠卵巢组织在37°C、5%C02、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，培养液A包含88% α -MEM, 10%胎牛血清，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU促卵泡素；培养分为四个阶段，每个阶段7天，共28天；在每个阶段分别设置不添加激活素A组，培养到28天时，收集胎鼠卵巢，并撕成碎小的组织块，0.25%胰酶，0.2%胶原酶IV，37°C处理lOmin，加入10%的胎牛血清+90%的DMEM配成的终止液后洗涤3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸盐缓冲液中反复洗涤，直至收集的样品中不再含有颗粒细胞；然后统计不同组的卵母细胞数目和直径大小；发现激活素A从小鼠出生前12天开始到出生后7天都发挥作用；2)利用细胞荧光染色和western blot检测减数分裂相关基因和蛋白的表达情况，确定激活素A促进雌性生殖细胞第一次减数分裂的进程:12.5dpc胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作:生殖嵴分离出来培养的当天定为0天，分离出的12.5dpc胎鼠生殖嵴，在37°C、5%C02、饱和湿度的培养箱里培养，培养液每两天换半液，贴壁培养4天，培养液包含88% α -MEM, 10%胎牛血清，1%丙酮酸钠，1%青链霉素，10mIU促卵泡素，100ng/ml激活素A ;通过实时荧光定量PCR、细胞荧光染色和western blot检测手段，确定激活素A加速第一次减数分裂的进程；3)利用免疫荧光组化的方法统计各组中原始卵泡的形成情况，激活素A促进原始卵泡库的建立:12.5dpc胎鼠生殖嵴的体外培养按照如下步骤操作:分离出12.5dpc胎鼠生殖嵴，在37°C、5%C02、饱和湿度的...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁桂金，刘京才，赖方秾，秦训思，程顺峰，沈伟，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：