一种雌性生殖干细胞的体外分离及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种雌性生殖干细胞的体外分离及培养方法，从雌性哺乳动物的卵巢的生殖上皮得到细胞，雌性生殖干细胞的分离纯化方法采用0.2％明胶和Matrigel差速贴壁结合克隆法，将未贴壁的雌性生殖干细胞与贴壁培养的其他细胞区分、分离。分离到的雌性性生殖干细胞培养在MEF饲养层上。分离到的雌性生殖干细胞具有ES细胞特性和向肌肉细胞、脂肪细胞和卵母细胞样细胞以及三个胚层在内的多种细胞的分化潜能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及动物干细胞的体外增殖、分化、分离，特别涉及。
技术介绍
生殖细胞的发生、增殖、分化的研究是生命科学研究的重要课题之一。在动物繁殖育种中，高产、优质的遗传资源完全依赖于生殖细胞来完成遗传；在人类，由于卵子的发生、成熟障碍等引起的不孕症更是困扰众多患者的一个现实问题；在基础研究中，卵子更是发育生物学研究的最重要研究对象之一；因此卵母细胞的发生、分化的研究，在畜牧业生产和生物医学研究中具有重要的意义。然而高等哺乳动物卵母细胞的发生、转移、分化完全在体内完成，因此很难动态实时地检测和研究其中的分子事件(Hua等，Recent advances in the derivation of germ cells from the embryonic stem cells. StemCells and Development,2008,17 :399-411)。干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。胚胎干细胞 (ES细胞或ESCs)是由早期胚胎内细胞团(ICM)或原始生殖细胞(PGCs)分离而来的多能干细胞。由于胚胎干细胞的独特生物学特性，使胚本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种雌性生殖干细胞的体外分离方法，其特征在于，包括以下步骤：１）分离细胞将从无菌采集的卵巢中分离的卵巢生殖上皮剪碎至碎块，用包含体积分数１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液重悬２～３次，静置之后得到下层的组织团；然后用包含质量分数０．１％的Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ　Ｉ、１０μｇ／ｍｌ　ＤＮａｓｅ和质量分数０．１％透明质酸酶的混合液消化处理组织团２～３次，每次２０～３０分钟，再用包含体积分数１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液重悬，分离得到卵巢源生殖细胞；２）雌性生殖干细胞的原代培养将得到的卵巢源生殖细胞以２×１０５个／ｍＬ的密度接种在经质量分数０．２％的明胶３７℃包被３０ｍｉｎ的塑料培养皿，...

【技术特征摘要】
1.一种雌性生殖干细胞的体外分离方法，其特征在于，包括以下步骤1)分离细胞将从无菌采集的卵巢中分离的卵巢生殖上皮剪碎至碎块，用包含体积分数10% FBS的 DMEM/F12培养液重悬2 3次，静置之后得到下层的组织团；然后用包含质量分数0. 1% 的Collagenase IUOyg/ml DNase和质量分数0. 1 %透明质酸酶的混合液消化处理组织团 2 3次，每次20 30分钟，再用包含体积分数10% FBS的DMEM/F12培养液重悬，分离得到卵巢源生殖细胞；2)雌性生殖干细胞的原代培养将得到的卵巢源生殖细胞以2X IO5个/mL的密度接种在经质量分数0.2%的明胶37°C 包被30min的塑料培养皿，培养液为雌性生殖干细胞分离培养液；所述雌性生殖干细胞分离培养液以DMEM/F12培养基为基础培养基，还包括以下组分 体积分数20%的胎牛血清与血清替代品(KSR)当中的一种、2mmol/L L-谷氨酰胺、lmmo 1/L 丙酮酸钠、0. lmmol/Li3 -巯基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、5 lOng/mL的碱性成纤维生长因子、2. 5ymol/L BIO(6-bromoindirubin-30-oxime), 100IU/ml 青霉素和 100mg/mL 链霄素；培养1 后将未贴壁的细胞转到经Matrigel基质膜4°C包被Ih的塑料培养皿培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：华进联，胡玥，白耀富，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：87