本发明专利技术公开了一种雌性生殖干细胞的体外分离及培养方法，从雌性哺乳动物的卵巢的生殖上皮得到细胞，雌性生殖干细胞的分离纯化方法采用0.2％明胶和Matrigel差速贴壁结合克隆法，将未贴壁的雌性生殖干细胞与贴壁培养的其他细胞区分、分离。分离到的雌性性生殖干细胞培养在MEF饲养层上。分离到的雌性生殖干细胞具有ES细胞特性和向肌肉细胞、脂肪细胞和卵母细胞样细胞以及三个胚层在内的多种细胞的分化潜能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及动物干细胞的体外增殖、分化、分离，特别涉及。
技术介绍
生殖细胞的发生、增殖、分化的研究是生命科学研究的重要课题之一。在动物繁殖育种中，高产、优质的遗传资源完全依赖于生殖细胞来完成遗传；在人类，由于卵子的发生、成熟障碍等引起的不孕症更是困扰众多患者的一个现实问题；在基础研究中，卵子更是发育生物学研究的最重要研究对象之一；因此卵母细胞的发生、分化的研究，在畜牧业生产和生物医学研究中具有重要的意义。然而高等哺乳动物卵母细胞的发生、转移、分化完全在体内完成，因此很难动态实时地检测和研究其中的分子事件(Hua等，Recent advances in the derivation of germ cells from the embryonic stem cells. StemCells and Development,2008,17 :399-411)。干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。胚胎干细胞 (ES细胞或ESCs)是由早期胚胎内细胞团(ICM)或原始生殖细胞(PGCs)分离而来的多能干细胞。由于胚胎干细胞的独特生物学特性，使胚胎干细胞在细胞替代治疗、组织器官修复与重建、基因治疗以及发育生物学模型、新药开发和毒理实验等，几乎所有的生命科学和生物医药领域均具有重要的意义。40多年前，科学家就发现雄性哺乳动物生殖器官中有雄性生殖干细胞-精原干细胞的存在，并成功地进行了体外培养。最近人们发现，成年动物睾丸的精原细胞在体外合适的条件下，可能转化为多能性的雄性生殖干细胞(Matsui等，Derivation of pluripotential embryonic stem cells from murine primordial germ cells in culture. Cell，1992，70 :841-847 ；董武子等，新生牛雄性生殖细胞源类ES的培养及检测， 畜牧兽医学报，2007，38 O) :144-148 ;Guan 等，Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis. Nature，2006，440 :1199-1203 ；Sesndel 等，Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+germline progenitors. Nature，2007，449 :346-350 ；Kanatsu-Shinohara 等，Pluripotency of a single spermatogonial stem cell in mice. Biol Reprod.，2008，78 (4) :681-687 ；Kanatsu 等， Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell，2004， 119 :1001-1012 ；Bukovsky 等，Generation of pluripotent stem cells from adult human testis. Nature，456，344-349 ；Kanatsu-Shinohara 等，Pluripotency of a single spermatogonial stem cell in mice. Biol Reprod.，2008，78 (4) :681-687)。所以，mGSCs 可做为转基因动物和克隆动物的理想载体细胞，而且比起正常的ES细胞，mGSCs细胞来源数量多，培养相对容易。但对于生殖细胞的研究来说，更为重要的是mGSCs能够有效地分化产生出精子(Ko 等，Induction of pluripotency in adult unipotent germline stem cells. Cell Stem Cell,2009，5 :87-96)。但对于雌性哺乳动物，传统观点认为所有生殖细胞都在雌性胎儿胚胎发育中进入减数分裂，出生后不再产生新的卵母细胞。因此，在其之后的生命周期中，只有有限的雌性生殖细胞存在于生殖细胞池中，随着年龄的增长，其数量将不断减少，而不存在一种干细胞对其进行补充和再生。近年来，有研究者提示出生后雌性小鼠的生殖细胞存在再生的活性。上海交通大学吴际教授首次从成年小鼠卵巢中分离并成功建立了雌性生殖干细胞(rescs)，并证明所得到的rescs具有分化形成卵母细胞，完成世代传递的潜力。因此其可望作为转基因动物生产、异种器官移植、大动物疾病模型研究等提供新的途径和平台，也可以作为哺乳动物生殖与发育研究的新途径，相对于传统的体细胞克隆和显微注射法转基因动物的生产方法，其具有简单、效率高的优点。在人类，可能开发利用卵巢上的众多潜在雌性生殖细胞，为生殖医学研究和临床开发新的珍贵卵母细胞来源。将有助于研究生殖细胞和卵子发生、凋亡等机理；对动物物种保藏、再生医学及卵巢功能早衰等不孕症的治疗将产生深远的影响。雌性生殖干细胞在线虫、果蝇和小鼠等模式动物上取得了一些进展，如建立了小鼠 FGSCs 的培养体系(Zou 等，Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries. Nat Cell Biol. 2009May ； 11 (5) :631-6.； Zou 等，Improved efficiency of female germline stem cell purification using Fragilis-based magnetic bead sorting. Stem Cells Dev. 201IMay 26. [Epub ahead of print].)。但对家畜如猪、牛、羊等的生殖干细胞，人们了解的仍很不够，尚未见有雌性生殖干细胞的分离培养方法。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供，从雌性哺乳动物的卵巢体外分离克隆雌性生殖干细胞，并对分离到的雌性生殖干细胞体外培养， 为研究雌性生殖细胞发生奠定基础。本专利技术是通过以下技术方案来实现一种雌性生殖干细胞的体外分离方法，包括以下步骤1)分离细胞将从无菌采集的卵巢中分离的卵巢生殖上皮剪碎至碎块，用包含体积分数10% FBS的DMEM/F12培养液重悬2 3次，静置之后得到下层的组织团；然后用包含质量分数 0. 1 %的Collagenase I、10 μ g/ml DNase和质量分数0. 1 %透明质酸酶的混合液消化处理组织团2 3次，每次20 30min，再用包含体积分数10% FBS的DMEM/F12培养液重悬， 分离得到卵巢源生殖细胞；2)雌性生殖干细胞的原代培养将得到的卵巢源生殖细胞以2X IO5个/mL的密度接种在经质量分数0. 2%的明胶 37°C包被30min的塑料培养皿，培养液为雌性生殖干细胞分离培养液；所述雌性生殖干细胞分离培养液以DMEM/F12培养基为基础培养基，还包括以下组分体积分数20%的胎牛血清与本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种雌性生殖干细胞的体外分离方法，其特征在于，包括以下步骤：１）分离细胞将从无菌采集的卵巢中分离的卵巢生殖上皮剪碎至碎块，用包含体积分数１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液重悬２～３次，静置之后得到下层的组织团；然后用包含质量分数０．１％的Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｉ、１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ和质量分数０．１％透明质酸酶的混合液消化处理组织团２～３次，每次２０～３０分钟，再用包含体积分数１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液重悬，分离得到卵巢源生殖细胞；２）雌性生殖干细胞的原代培养将得到的卵巢源生殖细胞以２×１０５个／ｍＬ的密度接种在经质量分数０．２％的明胶３７℃包被３０ｍｉｎ的塑料培养皿，培养液为雌性生殖干细胞分离培养液；所述雌性生殖干细胞分离培养液以ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养基为基础培养基，还包括以下组分：体积分数２０％的胎牛血清与血清替代品（ＫＳＲ）当中的一种、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－谷氨酰胺、１ｍｍｏｌ／Ｌ丙酮酸钠、０．１ｍｍｏｌ／Ｌβ－巯基乙醇、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ非必需氨基酸、５～１０ｎｇ／ｍＬ的碱性成纤维生长因子、２．５μｍｏｌ／Ｌ ＢＩＯ（６－ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３０－ｏｘｉｍｅ）、１００ＩＵ／ｍｌ青霉素和１００ｍｇ／ｍＬ链霉素；培养１２ｈ后将未贴壁的细胞转到经Ｍａｔｒｉｇｅｌ基质膜４℃包被１ｈ的塑料培养皿培养，培养液为雌性生殖干细胞分离培养液；未贴壁的细胞第一次转移培养１２ｈ后，将转移培养后再次未贴壁的细胞转移培养到经Ｍａｔｒｉｇｅｌ基质膜４℃包被１ｈ的塑料培养皿培养，培养液为雌性生殖干细胞分离培养液；未贴壁细胞第二次转移培养后，２ｄ更换１次培养液；细胞生长３～７ｄ后，开始出现致密胚胎干细胞样集落；３）雌性生殖干细胞的传代培养待致密胚胎干细胞样集落生长至周边开始出现分化细胞时，将致密胚胎干细胞样集落吸出，在ＰＢＳ中洗涤２次；再移到ＴｒｙｐＬＥ细胞消化液或质量分数０．０５％的胰蛋白酶中消化２～３ｍｉｎ，并吹吸５～２０次；将离散开的单细胞或小细胞团转移到经Ｍａｔｒｉｇｅｌ基质膜４℃包被１～２ｈ的塑料培养皿培养，培养液为雌性生殖干细胞分离培养液；３７℃、５％ＣＯ２饱和湿度条件下培养；培养３～７ｄ后，开始出现致密胚胎干细胞样集落，即为雌性生殖干细胞。...
【技术特征摘要】
1.一种雌性生殖干细胞的体外分离方法，其特征在于，包括以下步骤1)分离细胞将从无菌采集的卵巢中分离的卵巢生殖上皮剪碎至碎块，用包含体积分数10% FBS的 DMEM/F12培养液重悬2 3次，静置之后得到下层的组织团；然后用包含质量分数0. 1% 的Collagenase IUOyg/ml DNase和质量分数0. 1 %透明质酸酶的混合液消化处理组织团 2 3次，每次20 30分钟，再用包含体积分数10% FBS的DMEM/F12培养液重悬，分离得到卵巢源生殖细胞；2)雌性生殖干细胞的原代培养将得到的卵巢源生殖细胞以2X IO5个/mL的密度接种在经质量分数0.2%的明胶37°C 包被30min的塑料培养皿，培养液为雌性生殖干细胞分离培养液；所述雌性生殖干细胞分离培养液以DMEM/F12培养基为基础培养基，还包括以下组分 体积分数20%的胎牛血清与血清替代品(KSR)当中的一种、2mmol/L L-谷氨酰胺、lmmo 1/L 丙酮酸钠、0. lmmol/Li3 -巯基乙醇、0. lmmol/L非必需氨基酸、5 lOng/mL的碱性成纤维生长因子、2. 5ymol/L BIO(6-bromoindirubin-30-oxime), 100IU/ml 青霉素和 100mg/mL 链霄素；培养1 后将未贴壁的细胞转到经Matrigel基质膜4°C包被Ih的塑料培养皿培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：华进联，胡玥，白耀富，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：87
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