一种适合Vero细胞生长的低血清培养基制造技术

本发明专利技术研制了一种适合Vero细胞生长的低血清培养基，将常规培养小牛血清用量由10％(V组分)降至2％，并且将常规添加的动物源成分替换成植物源成分和重组蛋白。该低血清培养基降低血清的用量，不但降低了成本，而且减小培养基中血清携带外源病原菌污染的可能，同时减少了血清中大量的杂蛋白，利于下游产品的分离纯化；用植物水解蛋白和重组表皮生长因子替代动物源的成分，降低动物源成分的副作用，提高了生物制品的安全性。本发明专利技术研制的培养基不但使Vero细胞生长良好，而且降低成本，减少外源病原菌污染，减少后期纯化工艺，提高细胞产品生产的稳定性，为以Vero细胞为病毒宿主或表达载体的生物制品的生产提供了一种优质的培养基。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞无血清或低血清培养
，具体是关于一种适合Vero细胞生长的低血清培养基，用于VeiO细胞低血清培养及病毒的增殖。2.
技术介绍
Veix)细胞是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的生产疫苗的细胞系，它具有来源方便，生物安全性高，对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高等优点。普通的Vero细胞培养基中使用终浓度10% (体积)的小牛血清。但是血清所含的化学成分不确定，每个批次之间也存在着差异，同时血清的价格昂贵，还容易引起细菌、真菌、病毒和支原体污染；此外，血清中大量成分复杂的蛋白质会给疫苗、细胞因子和单克隆抗体等生物制品的分离纯化带来很大的困难。因此，尽量不用或少用血清成为VeiO细胞培养的趋势。现有技术常通过添加牛血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素等动物源成分，来降低血清的量。但是动物源成分的蛋白质对生物制品(如疫苗)的安全性有很大影响。专利技术人研制出一种Veix)细胞低血清培养基，既能够使细胞生长良好，形态正常，又减少了污染，提高细胞产品生产的稳定性，减少后期纯化工艺，降低生产成本。3.
技术实现思路
本专利技术旨在克服VeiO细胞常规培养中必须使用高含量小牛血清才能促进生长、安全性差的缺点，提供一种新的低血清培养基。这种培养基在DMEM(购自HyClone公司)作为基础培养基的条件下，在原有10%小牛血清的基础上，将血清浓度降低到2%，再在培养基中添加2-10g/L的大豆植物水解蛋白，20-100 μ g/L的表皮生长因子，25-50nM的亚硒酸钠，2_8mM的谷氨酰胺，50-200 μ M的柠檬酸铁，50-200 μ M的维生素C，150-300 μ M的乙醇胺，β -巯基乙醇0-50 μ Μ，丙酮酸钠0.5_2mM。与通过引入动物来源组分降低血清用量的培养方法相比，本专利技术研制的低血清培养基，引入的是植物源的蛋白质-大豆植物水解蛋白，重组表皮生长因子和一些化学合成物质。大豆植物水解蛋白是一种超滤、不含动物组分培养基添加物，它是由高度优化的消化过程生产而来的，在生产中使用了独特的混合酶，含有15种氨基酸成分。重组表皮生长因子和其他添加成分的来源明确 ，成分均一。使用这些成分替代动物源的成分能够促进VeiO细胞的生长。因此，本专利技术的Veix)细胞低血清培养基不产生伴随蛋白成分的副作用，安全性好。本专利技术研制此，本专利技术的VeiO细胞低血清培养基不产生伴随蛋白成分的副作用，安全性好。本专利技术研制的低血清培养基与常规培养的10%小牛血清相比形态相似，减少了污染，有利于细胞下游产品的分离、安全性好；与商用的无血清培养基相比，降低了成本，适于用作生产疫苗等生物制品的病毒宿主、表达载体的培养。4.附图说明图1是具体实施方式二中与10%小牛血清比较的Vero细胞培养48小时图片，图2是具体实施方式二中自制低血清培养基Vero细胞培养48小时图片，图3是具体实施方式二中与商用无血清相比VeiO细胞培养48小时图片。5.具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细描述:实施例1:本专利技术由5%小牛血清，大豆植物水解蛋白(￥组分)58/1，表皮生长因子2(^8/1，谷氨酰胺2mM组成，β -巯基乙醇30 μ M0本实施方式降低了常规培养使用的小牛血清的量，采用大豆植物水解蛋白，其成本低于使用常规培养基，并同时解决了因降低小牛血清的使用而造成的细胞过早死亡，形态不饱和的问题。实施例2:本专利技术由2%小牛血清，大豆植物水解蛋白(V组分)5g/L，表皮生长因子60μ g/L,谷氨酰胺4mM，亚硒酸钠50nM，柠檬酸铁100 μ Μ，维生素C 100 μ Μ，乙醇胺200 μ M组成，β -巯基乙醇30 μ Μ，丙酮酸钠ImM。本实施方式进一步降低血清的量，增加植物水解蛋白和表皮生长因子，增加了细胞的密度，提高了比生长速率，从而提高了医药领域的疫苗产量。配制方法:I)大豆植物水解蛋白母液的配制在实验室规模下使用大豆植物水解蛋白用于基本生长培养时，需要使用浓·缩且消毒的储存液。在我们实验室以100g/L的浓度作为储存液。称取IOg大豆植物水解蛋白粉末，将其溶解在IOOml基础培养基中，完全溶解后用0.22 μ m的无蛋白结合的注射器式过滤器进行消毒。如果在基础培养基中不易溶解，可以在过滤前将溶液置于37°C的培养箱中保持大约30分钟。然后贴上标签，放在4°C冰箱保存，备用。2)表皮生长因子的配制将表皮生长因子溶解在IOmM的醋酸中，用0.22mm的过滤器过滤除菌，贴上标签，放在-20°C，至少能够保存两年。必要的情况下分装成小管，使用时尽量避免反复冻融。3)谷氨酰胺的配制称取2.922g谷氨酰胺，溶解在IOOml三蒸水中，用0.22mm过滤器过滤除菌，用高压灭菌后的5ml离心管分装，贴上标签，-20°C保存。4)培养基的配制首先在基础培养基中加入2%的小牛血清，再分别加入大豆植物水解蛋白、表皮生长因子、谷氨酰胺、维生素C、柠檬酸铁、乙醇胺和亚硒酸钠，调节PH为7.2-7.4，用基础培养基定容至终体积，于2 V _8°C保存。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适合Vero细胞生长的低血清培养基，其特征在于以DMEM为基础培养基，在基础培养基中加入2ml的小牛血清，然后加入5g/L的大豆植物水解蛋白，60μg/L的表皮生长因子，30nM的亚硒酸钠，4mM的谷氨酰胺，100μM的柠檬酸铁，100μM的维生素C，200μM的乙醇胺，β?巯基乙醇30μM，丙酮酸钠1mM。请求对该新型低血清培养基的配方进行专利保护。

【技术特征摘要】
1.一种适合Vero细胞生长的低血清培养基，其特征在于以DMEM为基础培养基，在基础培养基中加入2ml的小牛血清，然后加入5g/L的大豆植物水解蛋白，60 μ g/L的表皮生长因子，30...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤承，岳华，苏晓蕊，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：