一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法技术

本发明专利技术涉及细胞技术领域，尤其涉及一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法。本发明专利技术提供的冻存液中包括基础培养液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2‑丙二醇，其对脂肪组织具有良好的保护作用，以本发明专利技术提供的冻存液对脂肪组织进行冻存后，再经复融的脂肪组织中，细胞活性保持良好。经原代分离培养，获得脂肪干细胞的成功率为100％。

Cryopreservation solution and method for the application of cryopreserved adipose tissue

The invention relates to the technical field of cells, in particular to a frozen liquid and a method for its application and cryopreservation of adipose tissue. The invention provides a frozen in liquid medium, including basic NEAA, DMSO, 1,2 glycerol and propylene glycol, which has a good protective effect on adipose tissue, which are provided by the invention of adipose tissue were frozen and frozen stock solution, after thawing in adipose tissue, maintain good cell activity. After primary culture and isolation, the success rate of adipose derived stem cells was 100%.

【技术实现步骤摘要】
一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法
本专利技术涉及细胞
，尤其涉及一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法。
技术介绍
脂肪组织(adiposetissue)：主要由大量群集的脂肪细胞构成，聚集成团的脂肪细胞由薄层疏松结缔组织分隔成小叶。脂肪组织中的网状纤维很发达。黄(白)色脂肪组织呈黄色(在某些哺乳动物呈白色)，即通常所说的脂肪组织。它由大量单泡脂肪细胞集聚而成，脂肪细胞呈圆形或多边形，细胞中央有一大脂滴，胞质呈薄层，位于细胞周缘，包绕脂滴。在HE切片上，脂滴被溶解成一大空泡。胞核扁圆形，被脂滴推挤到细胞一侧，连同部分胞质呈新月形。黄色脂肪组织主要分布在皮下组织、网膜和肠系膜等处，在成年男子一般约占体重的10％～20％，女人往往更多一些。脂肪组织是人体内最大的“能源库”。具有贮存脂肪、保持体温和参与脂肪代谢的功能。参与能量代谢，并具有产生热量、维持体温、缓冲保护和支持填充等作用。自体脂肪是一种理想的填充材料，几乎可用于全身各个部位的软组织缺损填充。尽管为了提高成活率和减少吸收率，国内外的研究人员进行了大量的研究，但目前移植后脂肪组织体积最终只能保持在移植时的50％左右。因此，临床上仍需要通过少量、反复、多次移植提高脂肪移植成活率，以达到患者满意的填充效果。但多次脂肪注射除增加了医生的工作量外，对患者造成多次抽脂的痛苦、较高的风险及费用。如果能实现一次抽取足够的脂肪体外长期冷冻储存，需要时复温培养后注射移植，则具有重要的临床应用价值。目前尚未有专们用于脂肪组织冻存的方法，经典的冻存液配方是FBS+DMSO，主要用在细胞冻存上，但该冻存液对脂肪组织的保存效果并不稳定。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法，以本专利技术提供的冻存液冻存脂肪组织，能够保护脂肪组织的活性，经复融后脂肪组织中的细胞仍保持良好的分化能力。本专利技术提供的冻存液包括：基础培养液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2-丙二醇。非必需氨基酸(non-essentialaminoacid，NEAA)，包含7种细胞培养所需非必需氨基酸，即天冬氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸。非必需氨基酸的添加能够增加细胞的繁殖力，延长细胞的生存时间。NEAA可为自行配置也可为市场购得，本专利技术对此不做限定，其实施皆在本专利技术的保护范围之内。本专利技术采用的NEAA为购自sigma的100×NEAA。本专利技术中，NEAA的体积分数为1％。DMSO：二甲基亚砜，是一种含硫有机化合物，分子式为(CH3)2SO，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。DMSO能快速通过细胞膜进入细胞内部，在细胞冷冻过程中，维持细胞内外的水和离子平衡，本专利技术实施例中，DMSO的体积分数为10％～20％；一个具体实施例中，DMSO的体积分数为20％。丙三醇为无色味甜澄明黏稠液体。无臭，有暖甜味，俗称甘油。具有保护细胞活性的作用。本专利技术实施例中，丙三醇的体积分数为5％～30％。一个具体实施例中，丙三醇的体积分数为15％。1,2-丙二醇的化学式为C3H8O2；其可与水、乙醇及多种有机溶剂混溶，具有保护细胞活性的作用。本专利技术实施例中，1,2-丙二醇的体积分数为5％～30％。一个具体实施例中，1,2-丙二醇的体积分数为15％。本专利技术实施例中，基础培养液DMEM/F12。本专利技术所用的基础培养液可为自制也可为购买获得，本专利技术对此不做限定，其实施皆在本专利技术的保护范围之内。本专利技术实施例中，基础培养基为DMEM/F12。一些具体实施例中，本专利技术提供的冻存液包括：一个具体实施例中，本专利技术提供的冻存液包括：一个具体实施例中，本专利技术提供的冻存液包括：一个具体实施例中，本专利技术提供的冻存液包括：本专利技术提供的冻存液在脂肪组织冻存中的应用。本专利技术实施例中，以本专利技术提供的冻存液冻存脂肪组织，3个月后复苏并进行原代分离培养，结果表明，复苏后的脂肪组织原代分离获得脂肪干细胞的成功率为100％。培养至第三代后，诱导脂肪干细胞向脂肪细胞分化。本专利技术还提供了一种冻存脂肪组织的方法，以本专利技术提供的冻存液与脂肪组织混合后，浸入液氮中。本专利技术实施例中，冻存液与脂肪组织的体积比为1：1。本专利技术提供了一种冻存液，其中包括基础培养液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2-丙二醇，其对脂肪组织具有良好的保护作用，以本专利技术提供的冻存液对脂肪组织进行冻存后，再经复融的脂肪组织中，细胞活性保持良好。经原代分离培养，获得脂肪干细胞的成功率为100％。附图说明图1示未经冻存的脂肪组织进行原代分离获得P2代脂肪干细胞的显微图；其中，图1-a示40放大；图1-b示100倍放大；图2示经实施例1冻存液保护下经冻存的脂肪组织复苏后，进行原代分离获得P2代脂肪干细胞的显微图；其中，图2-a示40放大；图2-b示100倍放大。具体实施方式本专利技术提供了一种冻存液及其应用与冻存脂肪组织的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1～3按照表1配方配制冻存液，然后灭菌：表1实施例1～3NEAA体积分数DMSO丙三醇1,2-丙二醇DMEM/F12实施例110mL200mL150mL150mL490mL实施例210mL100mL300mL300mL290mL实施例310mL200mL50mL50mL690mL采集人脂肪组织30份，随机分为3组，以等体积生理盐水清洗2遍后500g离心5min，弃上层油脂层和下层生理盐水层，用剪刀剪碎后过2mm筛网，然后各组脂肪组织分别以1:1的体积比与实施例1～3的冻存液混合，进入液氮中。保存3个月。对比例1～3按照表2配方配制冻存液，然后灭菌：表2对比例1～3NEAA体积分数DMSO丙三醇1,2-丙二醇DMEM/F12对比例110mL200mL----490mL对比例210mL--150mL150mL490mL对比例3--200mL150mL150mL490mL采集人脂肪组织30份，随机分为3组，以等体积生理盐水清洗2遍后500g离心5min，弃上层油脂层和下层生理盐水层，用剪刀剪碎后过2mm筛网，然后各组脂肪组织分别以1:1的体积比与对比例1～3的冻存液混合，进入液氮中。保存3个月。实施例4取未经冻存的脂肪组织为对照组，进行原代分离，获得P0代脂肪干细胞，在倒置显微镜下观察。以实施例1～3和对比例1～3配置冻存液冻存后的脂肪组织，经复苏后，进行原代分离，获得P2代脂肪干细胞，在倒置显微镜下观察(图1)。原代分离的方法为：终浓度0.2％的I型胶原酶消化35min后1800RPM-5MIN离心，仅保留底部沉淀，生理盐水清洗沉淀后接种培养得到P0细胞。统计分离成功率结果如表3：表3分离成功率分离成功率对照组100％实施例1100％实施例246.67％实施例336.67％对比例16.67％对比例20对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种冻存液，其特征在于，包括：基础培养液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2‑丙二醇。

【技术特征摘要】
1.一种冻存液，其特征在于，包括：基础培养液、NEAA、DMSO、丙三醇和1,2-丙二醇。2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述NEAA的体积分数为1％。3.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述DMSO的体积分数为10％～20％。4.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述丙三醇的体积分数为5％～30％。5.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述1,2-丙二醇的体积分数为5...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，葛啸虎，王一飞，黄幸，王小燕，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44