一种糜胰蛋白酶的提取方法技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，更具体地说涉及一种糜胰蛋白酶的提取方法。本发明专利技术采用ＣａＣｌ↓［２］激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶的同时加入（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］，使其生成ＣａＳＯ↓［４］沉淀吸附糜胰蛋白酶，不需要先采用盐析多重结晶结合透析和乙醇及丙酮等的有机溶剂法制备成糜胰蛋白酶粗制品，再通过ＣＭ－纤维素柱层析和亲和层析等复杂步骤，进行纯化制备，而直接经过洗脱，盐析、超滤和冻干步骤即可获得白色的冻干粉末。本发明专利技术提取方法简便可行，适于工业化生产，这样既节省了成本又缩短了时间，由原来约需７～８天时间缩短到３～４天。每公斤胰脏可获得冻干糜胰蛋白酶粉４．０～４．５克，其中糜蛋白酶的比活力为３５５Ｕ．／ｍｇ蛋白（氮），胰蛋白酶的比活力为１３６１Ｕ．／ｍｇ蛋白（氮）。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，更具体地说涉及。
技术介绍
糜蛋白酶和胰蛋白酶都是典型的丝氨酸蛋白酶，二者的性质极为相似，不 易分开，但是对蛋白质水解的专一性却各异。胰蛋白酶只作用于由碱性氨基酸L-精氨酸或赖氨酸的羧基所构成的C-末端肽键，而糜蛋白酶则选择性地水解由 芳族或脂族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸)所组成的肽键。因此，它们二者具 有协同水解蛋白质肽键的作用，比单独使用一种酶的效果好，适用范围更广。 目前国内外对它们作了大量的研究，并已作为一种抗炎消肿的药物，应用于临床。其他用途例如皮革工业脱去动物皮上的毛，纺织工业脱丝胶和水解酪蛋 白制水解乳蛋白等。 一般将它们从胰脏提取分离方法是采用盐析多重结晶结合 透析和乙醇及丙酮等的有机溶剂法。先将它们制备成糜胰蛋白酶的粗制品，然后再通过CM-纤维素柱层析和亲和层析等纯化，冻干获得纯度较高的糜胰蛋白酶，但是由于其制备工艺流程复杂，技术要求高，成本昂贵，不易广泛使用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供，采用CaCl2激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶，在成为糜胰蛋白酶的同时加入(NH4)2S04，使其生成CaS04沉淀吸附糜胰蛋白酶，以简化其生产工艺流程，縮短后续纯化 的周期和降低成本。本专利技术有下述顺序步骤a、 以新鲜牛胰脏或猪胰脏或冷冻牛胰脏或冷冻猪胰脏为原料，除去脂肪和 结缔组织，用清水洗净，再用绞肉机绞碎。b、 将绞碎的胰脏移入不锈钢桶中，加入3倍体积的自来水W/V，用15% 的H2SCV溶液V/V，将其调节至PH值为3.0，在室温下不断搅拌24小时，然后 用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得上清液I和胰脏残渣沉淀物I 。c、 将获得的上清液I倒入上清液桶内备用，将胰脏残渣沉淀物I用PH值 为3.0的自来水以1倍体积的量W/V进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分 钟的速度离心30分钟，获得上清液II和胰脏残渣沉淀物II 。d、 将上清液II倒入上清液桶内，将胰脏残渣沉淀物II用PH值为3.0的自 来水以1倍体积的量W/V进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心3o分钟，获得上清液in和胰脏残渣沉淀物ni，最后将上清液m倒入上清液桶 中，弃去胰脏残渣沉淀物III。e、 在上清液桶内，加入25% 30% (NH4) 2S04 W/V，搅拌均匀，静置2 小时，用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去杂蛋白沉淀，获得了清的上清 液。f、 在获得的清的上清液中，加入70% 75% (NHf) 2S04 W/V，用4000转/ 分钟的速度离心30分钟，沉降后弃去上清液，获得了糜胰蛋白酶原的沉淀。g、 在获得的糜胰蛋白酶原沉淀用PH值为3.0的去离子水溶解后，加入 4% 6%CaCl2W/V，搅拌均匀，在4。C 5。C下，静置10小时，使Ca^离子激活 糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶；然后再加10% 15%(NH4)2SO4W/V,搅拌均匀，5加温至37。C，使上清液中Ca离子生成CaS04沉淀(CaCl2+ (NH4) 2S04 — 2NH4Cl + CaS04 I )，吸附溶液中的糜胰蛋白酶，静置10小时后，用4000转/ 分钟的速度离心30分钟，沉降后，弃去上清液收集CaS04沉淀。h、用去离子水对沉淀后的CaS04反复洗脱三次，合并一起，然后加70% 75% (NH4) 2S04W/V，搅拌均匀，在4C下静置10小时，再用4000转/分钟的 速度离心30分钟，弃去上清液，得糜胰蛋白酶沉淀。最后用去离子水溶解后超 滤，冷冻干燥，获得了白色的糜胰蛋白酶冻干粉末。本专利技术的优点是提取分离方法简便可行，适于工业化生产，在用CaCl2 激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶的同时，加入(NH4) 2S(X使其生成CaS04 沉淀吸附糜胰蛋白酶，与弹性蛋白酶和胰酶等分开，不需要先采用盐析多重结 晶结合透析和乙醇及丙酮等有机溶剂法制备成糜胰蛋白酶的粗制品，再通过 CM-纤维素柱层析和亲和层析等复杂步骤，而直接经过洗脱，盐析、超滤和冻 干步骤即可。如果需要进一步分离糜胰蛋白酶的话，则可采用CM-纤维素将它 们分离为糜蛋白酶和胰蛋白酶，这样既节省了成本又縮短了时间，由原来约需 7 8天时间縮短到3 4天。每公斤胰脏可获得冻干糜胰蛋白酶粉4.0 4.5克， 其中糜蛋白酶的比活力为355U./mg蛋白(氮)，胰蛋白酶的比活力为1361U./mg 蛋白(氮)。具体实施方式 实施例1本专利技术有下述顺序步骤a、取1公斤新鲜牛胰脏为原料，除去脂肪和结缔组织，用清水洗净，再用 绞肉机绞碎。b、 将绞碎的牛胰脏移入不锈钢桶中，加入3000毫升的自来水W/V，用 15%的H2S04溶液V/V，将其调节至PH值为3.0，在室温下不断搅拌24小时， 然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得上清液I和胰脏残渣沉淀物I 。c、 将获得的3000毫升上清液I倒入上清液桶内备用，将胰脏残渣沉淀物 I用PH值为3.0的自来水1000毫升W/V进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000 转/分钟的速度离心30分钟，获得上清液II和胰脏残渣沉淀物II 。d、 将上清液II倒入上清液桶内，将胰脏残渣沉淀物II用PH值为3.0的自 来水1000毫升W/V进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得上清液ni和胰脏残渣沉淀物in，最后将上清液in倒入上清液桶中， 弃去胰脏残渣沉淀物m，另作他用，以免污染环境。e、 在上清液桶内，加入25% (NH4) 2S04W/V，搅拌均匀，静置2小时，用 4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去杂蛋白沉淀，获得了清的上清液。f、 在获得的清的上清液中，加入75% (NH4) 2S04W/V，用4000转/分钟 的速度离心30分钟，沉降后弃去上清液，获得了糜胰蛋白酶原的沉淀。g、 将获得的糜胰蛋白酶原沉淀用PH值为3.0的去离子水200毫升溶解后， 加入69iCaCl2W/V，搅拌均匀，在4i: 5-C下，静置10小时，使0&++离子激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶；然后再加10% (NH4) 2S04W/V，搅拌均匀，加△温至37°C，使上清液中Ca卩离子生成CaSCV沉淀(CaCl2+ (NH4) 2S04 — 2NH4Cl + CaS041 ),吸附溶液中的糜胰蛋白酶，静置10小时后，用4000转 /分钟的速度离心30分钟，沉降后，弃去上清液收集CaS04沉淀。h、 用去离子水400毫升对CaSO4沉淀反复洗脱三次，合并一起，然后加 75% (NH4) 2S04W/V，搅拌均匀，在4'C下静置10小时，再用4000转/分钟的 速度离心30分钟，弃去上清液，得糜胰蛋白酶沉淀；最后用去离子水溶解后超滤，冷冻干燥，获得了白色的糜胰蛋白酶冻干粉末。实施例2本专利技术有下述顺序步骤a、 取2公斤冷冻牛胰脏为原料，除去脂肪和结缔组织，用清水洗净，再用 绞肉机绞碎。b、 将绞碎的牛胰脏移入不锈钢桶中，加入6000毫升的自来水W/V，用15% 的H2S04溶液V/V，将其调节至PH值为3.0，在室温下不断搅拌24小时，然后 用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得上清液I和牛胰脏残渣沉淀物I 。c、 将获得的6000毫升上清液I倒入上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种糜胰蛋白酶的提取方法，该方法有以下顺序步骤：　ａ、以新鲜牛胰脏或猪胰脏或冷冻牛胰脏或冷冻猪胰脏为原料，除去脂肪和结缔组织，用清水洗净，再用绞肉机绞碎；　ｂ、将绞碎的胰脏移入不锈钢桶中，加入３倍体积的自来水Ｗ／Ｖ，用１５％的Ｈ↓［２］ ＳＯ↓［４］溶液Ｖ／Ｖ，将其调节至ＰＨ值为３．０，在室温下不断搅拌２４小时，然后用４０００转／分钟的速度离心３０分钟，获得上清液Ⅰ和胰脏残渣沉淀物Ⅰ；　ｃ、将获得的上清液Ⅰ倒入上清液桶内备用，将胰脏残渣沉淀物Ⅰ用ＰＨ值为３．０的自来水以１ 倍体积的量Ｗ／Ｖ进行搅拌洗涤２０分钟，然后用４０００转／分钟的速度离心３０分钟，获得上清液Ⅱ和胰脏残渣沉淀物Ⅱ；　ｄ、将上清液Ⅱ倒入上清液桶中；将胰脏残渣沉淀物Ⅱ用ＰＨ值为３．０的自来水以１倍体积的量Ｗ／Ｖ进行搅拌洗涤２０分钟，然后用４０ ００转／分钟的速度离心３０分钟，获得上清液Ⅲ和胰脏残渣沉淀物Ⅲ；最后将上清液Ⅲ倒入上清液桶中，弃去胰脏残渣沉淀物Ⅲ；　ｅ、在上清液桶中，加入２５％～３０％（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］Ｗ／Ｖ，搅拌均匀，静置２小时，然后用４０００转／ 分钟的速度离心３０分钟，弃去杂蛋白沉淀，获得了清的上清液；　ｆ、在获得的清的上清液中，加入７０％～７５％（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］Ｗ／Ｖ，用４０００转／分钟的速度离心３０分钟，沉降后弃去上清液，获得了糜胰蛋白酶原的沉淀；　ｇ、 将获得的糜胰蛋白酶原的沉淀用ＰＨ值为３．０的去离子水溶解后，加入４％～６％ＣａＣｌ↓［２］Ｗ／Ｖ，搅拌均匀，在４℃～５℃下，静置１０小时，使Ｃａ↑［＋＋］离子激活糜胰蛋白酶原成为糜胰蛋白酶；然后再加１０％～１５％（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］Ｗ／Ｖ，搅拌均匀，加温至３７℃，使上清液中Ｃａ↑［＋＋］离子生成ＣａＳＯ↓［４］沉淀（ＣａＣｌ↓［２］＋（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］＊２ＮＨ↓［４］Ｃｌ＋ＣａＳＯ↓［４］↓），吸附溶液中的糜胰蛋白酶，静置１０小时后，用４０００转／分钟的速度离心３０分钟，沉降后，弃去上清液收集ＣａＳＯ↓［４］沉淀；　ｈ、用去离子水对ＣａＳＯ↓［４］沉淀反复洗脱三次，合并一起，然后加７０％～７５％（ＮＨ↓［４］）↓［２］ＳＯ↓［４］Ｗ／Ｖ，搅拌均匀，在４℃下静置１０小时，再用４ ０００转／分钟的速度离心３０分钟，弃去上清液，得糜胰蛋白酶沉淀；最后用去离子水溶解后超滤，冷冻干燥，获得了白色的糜胰蛋白酶冻干...

【技术特征摘要】
1、一种糜胰蛋白酶的提取方法，该方法有以下顺序步骤a、以新鲜牛胰脏或猪胰脏或冷冻牛胰脏或冷冻猪胰脏为原料，除去脂肪和结缔组织，用清水洗净，再用绞肉机绞碎；b、将绞碎的胰脏移入不锈钢桶中，加入3倍体积的自来水W/V，用15％的H2SO4溶液V/V，将其调节至PH值为3.0，在室温下不断搅拌24小时，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得上清液I和胰脏残渣沉淀物I；c、将获得的上清液I倒入上清液桶内备用，将胰脏残渣沉淀物I用PH值为3.0的自来水以1倍体积的量W/V进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得上清液II和胰脏残渣沉淀物II；d、将上清液II倒入上清液桶中；将胰脏残渣沉淀物II用PH值为3.0的自来水以1倍体积的量W/V进行搅拌洗涤20分钟，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，获得上清液III和胰脏残渣沉淀物III；最后将上清液III倒入上清液桶中，弃去胰脏残渣沉淀物III；e、在上清液桶中，加入25％～30％(NH4)2SO4W/V，搅拌均匀，静置2小时，然后用4000转/分钟的速度离心30分钟，弃去杂蛋白沉淀，获得了清的上清液；f、在获得的清的上清液中，加入70％～75％(NH4)2SO4W/V，用4000转/分钟的速度离心30分钟，沉降后弃去上清液，获得了糜胰蛋白酶原的沉淀；g、将获得的糜胰蛋白酶原的沉淀用PH值为3.0的去...

【专利技术属性】
技术研发人员：马忠仁，印明善，冯玉萍，李明生，蔡翠萍，乔自林，冯若飞，阮小华，
申请(专利权)人：马忠仁，印明善，
类型：发明
国别省市：62[]