本发明专利技术涉及细胞领域，公开了一种NKT细胞诱导培养的添加剂及诱导培养NKT细胞的方法。本发明专利技术所述NKT细胞诱导培养的添加剂包括生长因子IL-21、IL-7和OKT-3。生长因子IL-21、IL-7和OKT-3与公认的生长因子IL-2和IL-15具有协同作用，可以更好地诱导和促进NKT细胞的增殖，能促进NKT细胞大量增殖，而且对于肿瘤细胞具有很好的杀伤效果。本发明专利技术所述诱导培养NKT细胞的方法，操作简单，能促进NKT细胞大量增殖，适合NKT细胞的规模化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞领域，具体涉及一种NKT细胞诱导培养的添加剂及诱导培养NKT细胞的方法。
技术介绍
自然杀伤T(naturalkillerT，NKT)细胞，是一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群。NKT细胞能够表达NKT细胞标志NKT1.1的T细胞，其机能具有T细胞和NKT细胞双重特征。NKT细胞在TCR和NKR介导下，产生大量的IL-4及INF-γ，对肿瘤细胞有杀伤作用。NKT细胞主要包括免疫调节和细胞毒作用，NKT细胞的抗原识别与传统的T细胞不同，不能识别由经典的MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子提呈的脂类、蛋白质抗原，在这些抗原的刺激下NKT细胞被激活，并迅速的产生IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-13等细胞因子，从而在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植免疫中发挥重要的作用。NKT细胞是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。NKT细胞以双刃剑的方式调节着免疫系统，越来越引起人们的关注，对NKT细胞的免疫活化及与疾病的关联的进一步研究将为人们在抗肿瘤、抗自身免疫性疾病及移植耐受中提供一新的有效的治疗手段，具有广泛的应用前景。目前，诱导培养NKT细胞的方法是从外周血中分离出单个核细胞，然后使用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基以及IL-2和IL-15两种细胞因子联合诱导培养得到NKT细胞。但现有的诱导培养NKT细胞的方法NKT细胞的扩增倍数不够大，用于免疫治疗或者亚健康保健的话很大程度影响免疫治疗效果。而且现有的诱导培养NKT细胞的方法使用胎牛血清，可能会引入一些支原体和病毒，存在一定的安全隐患。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种NKT细胞诱导培养的添加剂及诱导培养NKT细胞的方法。本专利技术所述NKT细胞诱导培养的添加剂能促进NKT细胞大量增殖，而且对于肿瘤细胞具有很好的杀伤效果。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种NKT细胞诱导培养的添加剂，包括生长因子IL-21、IL-7和OKT-3。生长因子IL-21、IL-7和OKT-3与公认的生长因子IL-2和IL-15具有协同作用，可以更好地诱导和促进NKT细胞的增殖。其中，在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子IL-21的用量为10ng/mL～100ng/mL。在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子IL-7的用量为10ng/mL～100ng/mL。在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子OKT-3的用量为20ng/mL～100ng/mL。在一些实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂还包括X-VIVO-15培养基。X-VIVO15无血清培养基，不含任何外源生长因子、人造细胞增殖刺激因子或不明成分的添加剂，可提供一个营养成分完全且平衡的体外环境，利于NKT细胞的生长和增殖。在一些实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂还包括生长因子IL-2和IL-15。在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子IL-2的用量为100U/mL～1000U/mL。在一些优选实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂中所述生长因子IL-15的用量为10ng/mL～100ng/mL。在一些具体实施方案中，所述NKT细胞诱导培养的添加剂由X-VIVO-15培养基、生长因子IL-2、IL-15、IL-21、IL-7和OKT-3组成，其中生长因子IL-2的用量为300U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL，所述生长因子IL-21、IL-7和OKT-3的用量均为50ng/mL。本专利技术还提供了一种诱导培养NKT细胞的方法，取外周血单个核细胞，按1×106cell/mL接种于NKT细胞诱导培养的添加剂中，放置37℃、5％CO2恒温培养箱中诱导培养；其中所述NKT细胞诱导培养的添加剂由X-VIVO-15培养基、生长因子IL-2、IL-15、IL-21、IL-7和OKT-3组成，其中生长因子IL-2的用量为300U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL，所述生长因子IL-21、IL-7和OKT-3的用量均为50ng/mL。在一些实施方案中，所述诱导培养NKT细胞的方法，还包括每隔2～3天对细胞进行补液的步骤。在一些优选实施方案中，所述诱导培养NKT细胞的方法中所述补液具体为按照1×106cell/mL密度添加X-VIVO15培养基以及IL-2、IL15、IL-21、IL-7和OKT-3，第七天后的补液只添加X-VIVO15培养基和IL-2、IL15；其中各生长因子的添加量均为培养基体积的1％。在一些具体实施方案中，所述在一些具体实施方案中补液时生长因子IL-2的用量为300U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL，所述生长因子IL-21、IL-7和OKT-3的用量均为50ng/mL；第七天后的补液的生长因子IL-2的用量为200U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL。在一个具体实施例中，本专利技术采用添加不同生长因子及不同培养基的NKT细胞诱导培养的添加剂培养单个核细胞，比较细胞活力。结果显示本发明所述NKT细胞诱导培养的添加剂培养的细胞增殖了45.5倍，远高于其它组细胞诱导培养添加剂，而细胞活力相当。表明本专利技术所述NKT细胞诱导培养的添加剂对NKT细胞具有很好的诱导增殖作用，而且保持着较高的活性。乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH在培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。在一个具体实施例中，本专利技术通过定量测量LDH来检测细胞的杀伤作用。结果显示本专利技术所述NKT细胞诱导培养的添加剂培养的细胞毒性增强，远高于其它组细胞诱导培养添加剂，表明用本专利技术所述NKT细胞诱导培养的添加剂培养NKT细胞可以提高NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。由上述技术方案可知，本专利技术提供了NKT细胞诱导培养的添加剂及诱导培养NKT细胞的方法。本专利技术所述NKT细胞诱导培养的添加剂包括生长因子IL-21、IL-7和OKT-3。生长因子IL-21、IL-7和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种NKT细胞诱导培养的添加剂，包括生长因子IL‑21、IL‑7和OKT‑3。
【技术特征摘要】
1.一种NKT细胞诱导培养的添加剂，包括生长因子IL-21、IL-7和OKT-3。
2.根据权利要求1所述的添加剂，所述生长因子IL-21的用量为10ng/mL
～100ng/mL，所述生长因子IL-7的用量为10ng/mL～100ng/mL，所述生长因
子OKT-3的用量为20ng/mL～100ng/mL。
3.根据权利要求1或2所述的添加剂，还包括X-VIVO-15培养基。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的添加剂，还包括生长因子IL-2和
IL-15。
5.根据权利要求4所述的添加剂，所述生长因子IL-2的用量为100U/mL
～1000U/mL，所述生长因子IL-15的用量为10ng/mL～100ng/mL。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的添加剂，由X-VIVO-15培养基、生
长因子IL-2、IL-15、IL-21、IL-7和OKT-3组成，其中生长因子IL-2的用量
为300U/mL，所述生长因子IL-15的用量为30ng/mL，所述生长因子IL-21、
IL-7和OKT-3的用量均为50ng/mL。
7.一种诱导培养NKT细胞的方法，取外周血单个核细胞，按1×106cell/mL
接...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈海佳，王一飞，葛啸虎，曾维杰，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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