用于评估肿瘤组织中免疫细胞的数量或密度的方法，所述方法包括由以下组成的步骤：a.提供通过使用特异性结合由免疫细胞表达的抗原(标志物)的抗体的自动化载片染色系统获得的一片或多片免疫染色的组织切片，b.通过高分辨率扫描捕获进行到步骤a.的载片的数字化，由此获得待分析载片的高清晰度(4.6μm/像素或更好)数字图像，c.检测数字图像上该片组织切片d.分析该片组织切片，用于定义(i)肿瘤(CT)和(ii)肿瘤的侵入性边缘(IM)，e.提供尺寸参考网格，其中均匀分布单元具有相同表面，所述网格适于待分析肿瘤的尺寸，e1.检查免疫染色的质量，f.检测和定量每个单元的染色细胞，由此评估每个单元染色的免疫细胞的数量或密度。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 专利
本专利技术涉及。
技术介绍
EP-A-EP1943520和W02007045996描述了用于预后患者的癌症的进展和/或存活， 和/或预测对治疗（化疗、放疗、生物治疗、免疫治疗）的响应的体外方法，所述方法包括W 下步骤： a)在来自所述患者的肿瘤组织样品中定量至少一种指示所述患者的局部适应性 免疫反应的状态的生物标志物；和 b)比较步骤a)获得的所述至少一种生物标志物的值与相同生物标志物的预定参 考值；所述预定参考值与所述患者的所述癌症的进展或存活的特定预后或治疗响应（诸如 化疗、放疗、生物治疗、免疫治疗）的预测相关联W预期"良好响应者"VS "差响应者"。 肿瘤组织样品可W选自（i)总体原发肿瘤（作为整体），（ii)来自肿瘤的组织样 品，（iii)来自直接包围肿瘤的组织的组织样品，所述组织选可W更具体地称为肿瘤的"侵 入性边缘"，（iv)与肿瘤密切接近的淋己岛，（V)位于肿瘤最接近处的淋己结，（vi)手术之 前进行的肿瘤活检，和（vii)远处转移。 优选在步骤a)中在从肿瘤的两个区域（分别为（i)肿瘤（CT)和（ii)肿瘤的侵 入性边缘（IM))收集的肿瘤样品中定量生物标志物。 在组织微阵列（TMA)上实施上述方法。然而，所述方法的大多数步骤手动执行，且 可能观察到测量的可重复性的问题。例如，基于苏木精-伊红复染检查，可W发生病理学家 之间选择肿瘤区域W打孔的差异。另外，观察到准确地打孔病理学家观察到的区域的困难。 此类典型错误可W发生在每一个步骤。尽管该些文献中描述的方法使得可能获得用于预测 癌症患者的存活的高性能，但研究仍继续至具有甚至更好品质的方法，特别是关于自动化 再现性和结果的可比性。 女口 Halama 等人在 Quantification of prognostic immune cell markers in colorectal cancer using whole slide imagining tumour maps, analytical and quantitative cytology and histology, Vol. 32, 6, Dec 2010, pp. 333-340 中所强调，使用 组织微阵列（TM)采样组织学探针在目标分子的空间异质性（如癌组织中经常观察到）的 情况下是特别成问题的。化lama等人提出全组织切片显微镜用于数据采集。然而，该研究 没有证明产生能够解释肿瘤的空间异质性的参数的特定诊断方法。他的结论是，直到生成 该诊断方法并进行后续研究，他不知道肿瘤图谱是否将在单个患者中具有预后价值。[000引专利技术简述 现在，本申请人已经发现用于评估肿瘤组织中免疫细胞的数量或密度、用于获得 患有癌症的患者的免疫评分（或免疫评分）的方法。 已经W令人梅讶和意料之外的方式注意到，用于评估肿瘤组织中免疫细胞的数量 或密度的新方法的使用确保了 W02007045996中描述方法的自动化、可重复性和再现性，并 且因此提供了用于预测癌症患者的存活率和治疗响应的实验室间测试的标准测试方法。 当与EP-A-EP1943520和W02007045996的方法相比时，新方法具有特别较少的可 重复性和再现性的问题。 优选实施方案的描述 因此，本申请的主题是用于评估肿瘤组织中免疫细胞的数量或密度的方法，所述 方法包括由W下组成的步骤： a.提供通过使用特异性结合由免疫细胞表达的抗原的抗体的自动化载片染色系 统获得的一片或多片免疫染色的组织切片。 b.通过高分辨率扫描捕获进行到步骤a.的载片的数字化，由此获得待分析载片 的高清晰度（4. 6 y m/像素或更好）数字图像， C.检测数字图像上该片组织切片[001引 d.分析组织切片，用于定义（i)肿瘤（CT)和m)肿瘤的侵入性边缘（IM)， e.提供尺寸参考网格，其中均匀分布单元具有相同表面，所述网格适于待分析肿 瘤的尺寸， f.检测和定量每个单元的染色细胞，由此评估每个单元染色的免疫细胞的数量或 密度。 通常，抗体对于由免疫细胞表达的蛋白是特异性的，更具体地对于免疫细胞表面 标志物是特异性的。例如，抗体可对于如W02007045996中描述的标志物是特异性的，考虑 的免疫细胞可W是B细胞和优选是T细胞。例如，本专利技术的T细胞是亚群CD3+细胞（T细 胞）、CD8+细胞或GZMB+细胞（细胞毒性T细胞）、CD4+细胞（T辅助细胞）、CD45R0+细胞 (记忆性T细胞）的T细胞。在一个具体实施方案中，抗体对于CD3、CD4、CD8、CD20、CD45R0、 和GZMB标志物是特异性的。 当使用两种或更多种标志物时，优选对于每种标志物单独实施上述步骤。例如，抗 CD3抗体用于一个组织切片，且抗CD8抗体用于另一个组织切片，优选邻近的组织切片。当 不同地染色用于检测不同标志物的抗体时，可替代地进行多重（例如双重）检测。因此，每 种标记物可用一种可检测信号。 免疫组织化学或I肥是指通过使用抗体特异性结合生物组织中的抗原的原理检 测组织切片的细胞中的抗原（通常是蛋白）的常规方法。免疫组织化学染色允许可视化抗 体-抗原相互作用。它可多种方式来实现。在最常见的实例中，将抗体缀合至酶，诸如 过氧化物酶，其可催化产生颜色的反应。或者，抗体也可W标记至英光团，诸如英光素或若 丹明。 本专利技术中使用的抗体通常是可商购的。具体而言，当选择CD3标志物用于实施本 专利技术的方法时，商购自Roche VentanaCTucson, AZ,USA)的2GV6抗体可W是合适的烟letty R，等人，J化thol. 173 (4): 303-307, 1994)。具体而言，当选择CD8标志物用于实施本发 明的方法时，商购自Dako(Denmark)的C8/144B抗体可W是合适的（Mason DY,Cordell JL, Gaulard P, Tse AGD, Brown MH. Immunohistological detection of human cytotoxic/ suppressor T cells using antibodies to a CDSpeptide sequence. J Clin Pathol 1992:45:1084-8)〇当实施该方法时可W检测两种或更多种标志物。在具体实施方案中，可W使用 W 下组合；CD3+CD8、CD3+CD45R0、CD3+CD20、CD3+GZMB、CD8+CD20、CD8+GZMB、CD8+CD45R0、 CD20+GZMB、CD20+CD45R0、GZMB+CD45R0、CD4+CD8、CD4+CD45R0、CD4+GZMB、CD4+CD20 和 CD3、 CD8、CD20、CD45R0、CD4和GZMB标志物中的3种标志物的所有组合。在用于实施本专利技术的 优选条件下，组合CD3+CD45R0、CD8+CD45R0和CD3+CD8是最优选的，更特别是后者，因为用 该些抗体获得的背景染色低。 可W在本方法中使用不同类型肿瘤的组织切片。肿瘤组织样品涵盖（i)总体原发 性肿瘤（作为整体），（ii)来自肿瘤的组织样品（活检样品），（iii)切除的肿瘤样品，和 (iv)远处转移样品。 用一本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于评估肿瘤组织中免疫细胞的数量或密度的方法，所述方法包括由以下组成的步骤：a.提供通过使用特异性结合由免疫细胞表达的抗原(标志物)的抗体的自动化载片染色系统获得的一片或多片免疫染色的组织切片，b.通过高分辨率扫描捕获将步骤a.的载片进行数字化，由此获得待分析载片的高清晰度(4.6μm/像素或更好)数字图像，c.检测数字图像上的组织切片d.分析该片组织切片，用于定义(i)肿瘤(CT)和(ii)肿瘤的侵入性边缘(IM)，e.提供尺寸参考网格，其中均匀分布单元具有相同表面，所述网格适于待分析肿瘤的尺寸，e1.检查免疫染色的质量，f.检测和定量每个单元的染色细胞，由此评估每个单元染色的免疫细胞的数量或密度。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：J·加隆，F·帕热斯，B·米莱克尼克，
申请(专利权)人：国家医疗保健研究所，雷卡尔巴黎大学，巴黎公共救济院，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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